1、本科毕业设计（20_届）乌贼墨汁多糖的提取工艺研究所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言32材料和方法321实验材料3211原料4212试剂4213主要仪器和设备4214其他器材422实验方法4221乌贼墨汁多糖的提取4222苯酚硫酸法测多糖含量4223标准曲线的制备5224多糖含量的测定5225墨汁多糖提取条件优化53结果和讨论631加酶量对墨汁多糖提取的影响632料水比对墨汁多糖提取的影响633PH对墨汁多糖提取的影响734提取温度对墨汁多糖提取的影响735提取时间对墨汁多糖提取的影响836多糖提取正交实验分析937验证实验104结论105展望11致谢
2、错误未定义书签。参考文献11附录错误未定义书签。摘要本文以乌贼墨作为实验研究对象，从中提取墨汁多糖。研究了加酶量、料水比、PH、提取温度、提取时间五个因素，通过对加酶量、料水比、PH、提取温度、提取时间进行单因素分析确定各个因素对多糖提取的影响，根据单因素实验结果，对加酶量、料水比、提取温度、提取时间四个因素进行L934正交实验。通过对实验结果的分析，确定了墨汁多糖的最佳提取方案为料水比为125、加酶量为原料量的45、提取温度为50、提取时间为4H。在此提取条件下，乌贼墨汁多糖的提取率为363。关键词墨汁多糖；提取；正交ABSTRACTTHISESSAYEXTRACTSINKPOLYSACCH
3、ARIDEFROMSEPIAWHICHISCONSIDEREDASEXPERIMENTALRESEARCHOBJECTINTHISESSAY,MAINLYSTUDIESFOLLOWINGFIVEFACTORSINCLUDINGENZYMECONCENTRATION、THERATIOBETWEENMATERIALANDWATER、PH、EXTRACTIONTEMPERATUREANDEXTRACTIONTIMEANDTHENANALYZETHEIRINFLUENCEONTHEEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDEACCORDINGTOTHESINGLEFACTOREXPERIMEN
4、TRESULTS,CARRYOUTAORTHOGONALEXPERIMENTL934BASEDONENZYMECONCENTRATION、THERATIOBETWEENMATERIALANDWATER、EXTRACTIONTEMPERATUREANDEXTRACTIONTIMEBYANALYZINGTHERESULTSWEOBTAINTHEOPTIMIZEDEXPERIMENTALPARAMETERSOFEXTRACTIONTHERATIOBETWEENMATERIALANDWATERIS125、THEQUANTITYOFADDINGENZYMEIS45OFRAWMATERIAL、EXTRAC
5、TIONTEMPERATUREIS50、EXTRACTIONTIMEIS4HUNDERTHISCONDITIONTHEEXTRACTIONRATIOOFSEPIAINKPOLYSACCHARIDEIS363KEYWORDSSEPIAINKPOLYSACCHARIDEEXTRACTIONORTHOGONAL1引言乌贼本名乌鲗，又称花枝、墨斗鱼或墨鱼，属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科乌贼属的一种海洋动物，具有较高营养和多种药用功能。常见种类有金乌贼、虎斑乌贼、白斑乌贼、拟目乌贼、罗氏乌贼、曼氏无针乌贼等1。乌贼肉质细嫩，除了含有高蛋白、低脂肪外，还是含有大量牛磺酸的低热量食品。因可抑制血中的胆固醇
6、含量，预防成人病、缓解疲劳、恢复视力、改善肝脏功能而倍受人们的青睐。乌贼具有高营养、生活史较短（通常一年）、生长快和分布广等特点，是一类很有发展前景的海水养殖种类，也是海洋中最大、最具潜在价值的蛋白质资源。乌贼墨存在于墨囊中，是乌贼遇到天敌时喷出来染黑周围水域的黑色物质，以混乱天敌视野和麻痹天敌嗅觉，乌贼籍此方式逃生。现代医学研究表明，乌贼墨具有多种生理活性，乌贼墨在“本草纲目”中记有“肤中墨主治血刺心痛”之功效。现代临床应用证明它是一种良好的全身性止血药，对妇科、外科、内科等多种出血，止血效果显著，无毒副作用。乌贼墨不仅可以止血，而且有可能通过有效地控制出血使全身机能状况改善，调动机体自身调
7、节功能，使功能恢复正常。同时对支气管扩张咯血、鼻出血、尿血、肺癌咯血、宫颈癌出血等也有一定的疗效2。乌贼墨经提取、分离和纯化，得到了一种全新结构的粘多糖，这种粘多糖与蛋白分子相连，构成一种比较复杂的蛋白质多糖复合体，是一种高效抗癌活性成分，说明乌贼墨具有抗肿瘤作用35。乌贼墨有抗辐射作用。乌贼墨可保护造血干细胞，有显著促使环磷酞胺所致白细胞降低的回升作用，可预防大白鼠急性放射病6。有日本学者指出在鱿鱼的腌制发酵产品中加入乌贼墨能显著改善其保存性能，添加乌贼墨后使得鱿鱼在储藏期间化学变化变慢7。国内有学者研究表明，乌贼墨中的肽聚糖是发挥抗菌作用的主要物质8。乌贼墨的化学成分除了黑色素还有蛋白多糖
8、复合体。多糖又称为多聚糖，是构成生命的四大基本物质之一，它存在于生物体一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动，有多种多样的生物学功能。多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖。多糖类物质包括糖原，甲壳素，肝素，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸角质素，酸性粘多糖或糖胺聚糖。其中肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖海洋动物作为动物多糖的重要来源之一，由于在体内常以蛋白质结合状态存在，故也统称为蛋白聚糖9，具有多种特殊的生物学功能。多糖的提取目前常用碱解法、热水浸提法、酶解法或碱解与酶解相结合的方法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法。如刘兴杰等10碱提取法从绿疣海葵等四种海洋无
9、脊椎动物中提取酸性粘多糖。陈菊嫡等11用碱解法提取分离花刺参酸性粘多糖；MYSORE12用热水浸提法提取高粱中的多糖。张红岩等13用木瓜酶消化方法提取分离鹿茸中酸性多糖CMAES等14用碱性过氧化氢提取小麦麸皮中的非淀粉多糖。唐孝礼等15用碱解与酶解相结合的方法提取分离黑海参酸性粘多糖。邓永智16等利用微波辅助提取法从海水小球藻中提取多糖。钟丹等17采用超声波提取牛蒡菊糖。由于乌贼墨汁多糖是一种动物多糖，在体内常以蛋白质结合状态存在，是一种蛋白聚糖，利用酶解法可以有效去除蛋白，并且具有条件温和、得率高等优点。因此本实验采用酶解法。在我国，人们在吃乌贼时通常将墨囊弃去或把墨汁洗尽，同时随着国内水
10、产加工业的发展，生产过程产生的下脚料逐年增多，乌贼墨也常作为下脚料被丢弃，造成环境污染和资源浪费。开发利用乌贼墨不仅可变废为宝，获得经济效益，还可以改善环境，取得良好的社会效益。目前，研究乌贼墨汁多糖的相对较少。对乌贼墨汁多糖的提取工艺进行研究，具有重要的实践意义。2材料和方法21实验材料211原料金乌贼普通宁波市江北区庄市菜市场212试剂蒸馏水二级水宁波大学浓硫酸分析纯兰溪市六洞山化工试剂厂氢氧化钠分析纯杭州市瓶窑和顺化工试剂厂苯酚分析纯国药集团化学试剂有限公司三氯乙酸分析纯如皋市金陵试剂厂碱性蛋白酶20万U/G南京庞博生物工程有限公司乙醇96奥博生物有限公司三氯乙酸溶液（15）称取15G三
11、氯乙酸于烧杯中，溶于水，移到100ML容量瓶中，用水稀释到刻度。6苯酚取6ML苯酚与烧杯中，转移至100ML容量瓶中，用水稀释至刻度。现配先用。213主要仪器和设备电热恒温水浴锅DKS22型上海精宏实验设备有限公司PH测量仪DELTA320梅特勒托利多仪器（上海）有限公司分光光度计T6新锐北京普析通用仪器有限责任公司分析天平JD型余姚市金诺天平仪器有限公司高速冷冻离心机H2500R2型长沙湘仪离心机仪器有限公司旋转蒸发器RE522上海沪西分析仪器厂冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司214其他器材试管若干、锥形瓶若干、比色杯若干、比色管若干、试管架、滴定管、剪刀、移液管、镊子、塞子若干、量筒、
12、洗耳球、洗瓶等。22实验方法221乌贼墨汁多糖的提取本实验的基本路线为墨囊解冻挤出墨汁加水，调PH值，加酶水浴灭酶离心取上清液三氯乙酸除杂蛋白离心取上清液旋转蒸发浓缩乙醇沉淀干燥得粗多糖墨汁多糖提取工艺优化墨汁多糖提取单因素分析墨汁多糖提取多因素正交试验分析进行验证实验具体操作将乌贼墨囊于4条件下解冻，从墨囊中挤出墨汁备用，称取2G墨汁于锥形瓶中，加入蒸馏水，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液将溶液的PH调至8，然后加入一定量的碱性蛋白酶进行酶解，在特定温度下水浴一段时间，结束后置于电磁炉上100条件下灭酶10MIN，将灭完酶的溶液用高速冷冻离心机下在9000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，
13、在上清液中加入四分之一体积的15的三氯乙酸溶液过夜，加三氯乙酸的目的是，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀18，从而提高多糖的纯度。将加三氯乙酸过夜的溶液用高速冷冻离心机下在9000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，将得到的上清液用苯酚硫酸法测定多糖含量，最后将上清液置于旋转蒸发器中浓缩，浓缩后的容易PH调至7，再加入浓缩液四倍体积的乙醇让多糖沉淀，将沉淀进行冷冻干燥后得到微黄色样品，即为墨汁粗多糖。222苯酚硫酸法测多糖含量多糖的含量测定的方法可分为两大类19一类是直接测定法，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法
14、等。本实验采用苯酚硫酸法测定多糖含量。苯酚硫酸法的原理为糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490NM波长下有最大吸收峰，在此波长下测定吸光度，进而得到糖含量。223标准曲线的制备准确称取标准葡萄糖100MG于100ML容量瓶中，加水至刻度，取10ML定容至100ML分别吸取02、04、06、08、10ML，各以蒸馏水补至20ML，然后加入6苯酚10ML及浓硫酸50ML，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490NM测吸光度，以20ML水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖。单位为G/ML。纵坐标为吸光度，得标准曲线。本实验测得
15、标准曲线，其回归方程为Y00076X00037，相关系数R209991，如图1所示。糖含量标准曲线Y00076X00037R2099910100102030405060708020406080100120浓度（G/ML）吸光度（490NM）图1多糖含量标准曲线FIGURE1THESTANDARDCURVEOFPOLYSACCHARIDECONTENT224多糖含量的测定每次取1G样品进行实验，按221中的实验步骤得到加了三氯乙酸过夜的溶液，置于高速冷冻离心机下在9000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，将上清液定容至100毫升的容量瓶中。再吸取10ML于50ML容量瓶中，从中吸取1M
16、L的样品液，以蒸馏水补至20ML，然后在通风橱中操作，向各个管中用移液枪加入6苯酚10ML，用移液管向各个管中加入浓硫酸50ML，摇匀冷却后，在室温下放置20分钟以后，用分光光度计于490NM波长下测定吸光度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。多糖提取率（）100M50/（01M106）M/20M式中M经标准曲线算出的多糖含量，单位为微克（G/ML）M样品质量，单位为克（G）225墨汁多糖提取条件优化针对加酶量、料水比、提取温度、提取时间、PH值这五个条件对墨汁多糖提取的影响，分别对这五个因素进行单因素实验，在保持其他提取条件不变的情况下，分析在各自单一变量条件下的最佳提取值。根据这
17、五个条件的单因素分析结果，再确定其中四个因素及其水平条件进行正交试验，分析确定最佳的提取条件及各提取条件对乌贼墨汁多糖的提取的影响程度，最后根据分析所得的最佳提取条件进行验证实验。3结果和讨论31加酶量对墨汁多糖提取的影响采用碱性蛋白酶作为提取多糖的添加酶（其最适反应PH为8，比活为20万U/G）。在料水比为110，提取温度为40，提取时间为2H的条件下，碱性蛋白酶的加入量分别为原料质量的25，30，35，4，45，5六个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图2所示。0051152253354225335445555加酶量（）多糖
18、提取率（）图2加酶量对墨汁多糖提取的影响FIGURE2THEEFFECTSOFENZYMECONCENTRATIONONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图2可以看出，在料水比为110，提取温度为40，提取时间为2H的条件保持不变的情况下，随着酶用量的增加，多糖的提取率呈现出不断上升的趋势至添加量为4时曲线增幅变缓，这表明添加量至4时，对多糖的提取影响变弱，综合经济方面的考虑，选用加酶量为原料量的4为此因素的条件。32料水比对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，提取温度为40，提取时间为2H的条件下，料水比分别为15，110，115，120，1
19、25五个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图3所示。由图3可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，提取温度为40，提取时间为2H的条件保持不变的情况下，随着料水比的增加，多糖提取率先增大后减小，并在料水比为20时达到最大，多糖提取效果最好，因此选用料水比20时为此因素的条件。32533335343453535536051015202530料水比多糖提取率（）图3料水比对墨汁多糖提取的影响FIGURE3THEEFFECTSOFTHERATIOOFRAWMATERIALSANDWATERONEXTRACTIONOFP
20、OLYSACCHARIDES33PH对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，料水比110，提取温度为40，提取时间为2H的条件下，PH分别为7，8，9，10，11五个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图4所示。275282852929533056789101112PH多糖提取率（）图4PH对墨汁多糖提取的影响FIGURE4THEEFFECTSOFPHONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图4可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，料水比110，提取温度为40，提取时间为2H的条件保持不
21、变的情况下，随着PH的增加，多糖提取率在PH810之间变化不大，PH大于10时迅速减小，并在PH为8时达到最大，这是因为碱性蛋白酶的最适PH为8左右，当PH大于10时，碱性蛋白酶发生变性，导致多糖提取率下降。因此实验时保持溶液的PH为810时对结果影响不大。34提取温度对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取时间为2H的条件下，提取温度分别为30，40，50，60，70五个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图5所示。292953305313153232520304050607080提
22、取温度（）多糖提取率（）图5提取温度对墨汁多糖提取的影响FIGURE5THEEFFECTSOFTEMPERATUREONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图5可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取时间为2H的条件保持不变的情况下，随着温度的增加，多糖提取率先增大后减小，并在提取温度为50时达到最大，多糖提取效果最好，因此选用提取温度为50时为此因素的条件。35提取时间对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取温度为40的条件下，提取时间分别为1H，2H，3H，4H，5H五个水平进行实验。根据
23、实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图6所示。32322324326328333323343363380123456提取时间（H）多糖提取率（）图6提取时间对墨汁多糖提取的影响FIGURE6THEEFFECTSOFTIMEONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图6可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取温度为40的条件保持不变的情况下，随着提取时间的增加，多糖提取率先增大后减小，并在提取时间为3H时达到最大，多糖提取效果最好，因此选用提取时间为3H时为此因素的条件。36多糖提取正交实验分析根
24、据之前所做的单因素实验及其结果分析。选择料水比、加酶量、提取温度、提取时间四个因素进行正交实验。确定四因素三水平L934的正交试验中四个因素的水平分别为，料水比115，120，125；加酶量35，40，45；提取温度40，50，60；提取时间2H，3H，4H。具体因素水平见表1表1正交因素水平表TABLE1THELEVELOFORTHOGONALFACTORS因素水平A料水比B加酶量（）C提取温度（）D提取时间（H）111535402212040503312545604按照四因素三水平L934正交表的实验设置进行9次实验，实验中为避免误差过大，每次实验都做了3组平行取平均值，实验结果的直观分析
25、见表2，方差分析见表3表2正交实验结果和直观分析TABLE2THERESULTSOFORTHOGONALEXPERIMENTSANDVISUALANALYSIS实验编号ABCD多糖提取率（）111112572122234631333325421232905223130162312344731322478321335093321354K1928794951912K2935997990937K39511023873965K13093264731703040K23117332333003123K33170341029103217极差R0077076303900177因素主次BCDA优方案A3B3C2
26、D3表3正交实验方差分析表TABLE3VARIANCEANALYSISOFORTHOGONALEXPERIMENT差异源偏差平方和自由度F比F临界值（010）显著性A0009200273110B1048231263110C0237207073110D0047201403110误差1348从表2的直观分析中的极差数据可知，本次实验中针对的料水比、加酶量、提取温度、提取时间四个实验条件中，影响墨汁多糖提取的因素主次关系为B（加酶量）C（提取温度）D（提取时间）A（料水比）。由于吸光度越大，溶液中被提取出来的多糖含量越高。因此从表2中确定实验的墨汁多糖的最佳提取方案为A3B3C2D3。也就是料水比为
27、125、加酶量为原料量的45、提取温度为50、提取时间为4H。另外，表3的方差分析表明墨汁多糖提取因素中的加酶量对墨汁多糖的提取的影响存在着显著的差异（010），显著水平差异值的结果与极差分析结果一致。37验证实验根据正交实验结果的数据分析得出的墨汁多糖最佳提取方案A3B3C2D3为料水比为125、加酶量为原料量的45、提取温度为50、提取时间为3H。这个实验各因素水平的组合在正交试验中没有出现，须通过实际实验来验证理论分析的结果，故做验证实验来进一步验证正交实验中的分析结果是否完全正确。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后离心取得的上清液，用苯酚硫酸法在490NM条件下测吸光度，再根据公式求得多糖
28、提取率。验证实验的结果如表4所示。表4验证实验结果TABLE4THERESULTOFVERIFICATIONEXPERIMENT实验编号A料水比B加酶量（）C提取温度（）D提取时间（H）吸光度A112545504054821254550405463125455040549验证实验的3组平行实验结果表明在料水比为125、加酶量为45、提取温度为50、提取时间为4H的条件下，在490NM下测得的吸光度的平均值为0548。根据公式得出多糖的提取率为363。这说明正交实验分析得出的最佳提取方案A3B3C2D3，即料水比为125、加酶量为原料量的45、提取温度为50、提取时间为4H是正确的。4结论本实验
29、选用金乌贼墨汁多糖的提取作为实验研究对象，在众多的影响多糖提取的条件中挑选了加酶量、料水比、PH、提取温度、提取时间作为实验的研究因素，在保持其他条件不变的情况下，先依次对各个因素进行单因素分析确定各自的最佳因素水平。然后根据单因素分析的结果，最终合理设置了四因素三水平的L934正交实验，通过对正交实验结果的分析，我们确定了影响墨汁多糖提取即影响墨汁多糖提取率因素主次关系为B（加酶量）C（提取温度）D（提取时间）A（料水比）。并且通过实际的验证实验证明了正交实验分析的最佳提取方案为料水比为125、加酶量为原料量的45、提取温度为50、提取时间为4H的正确性。并且计算得出，在此提取条件下，墨汁多
30、糖的提取率为363。但是由于D（提取时间）和A（料水比）对多糖提取的影响并不显著且各自的K值相差较小，为减少提取时间提高提取效率和减少用水量，考虑成本问题，在实际应用中可采用加酶量为原料量的45，提取温度为50，提取时间为2H，料水比为115。5展望多糖的研究具有巨大的潜力。多糖是从机体中制取的天然生物高分子，与人体细胞有良好的生物兼容性，不具有毒性而且可以被生物体分解，具有生物活性，因此可广泛地应用在医药食品等方面。如针对众多的多糖类疾病，人们在利用外源性动物中氨基多糖的生物活性研制有效药物方面进行了尝试。一些药用氨基多糖已在临床治疗中应用，如用于治疗心脑血管疾病的药物肝素20。从中国林蛙皮
31、21中分离提取的透明质酸无毒无害，可将其作为保湿嫩肤型化妆品的添加剂，也可将其应用于保健食品的生产。我国对多糖的研究起步较晚，但近年来的工作取得了较大的进展，越来越多的多糖被发现。并被证实它们具有复杂、广泛的生物活性和功能。随着对多糖生物活性研究的不断深入，多糖的生物活性机理，功效因子等会更加明确，它的应用领域也将会更加宽阔。然而，由于多糖本身结构比较复杂且种类繁多，其提取分离纯化有很大的难度，有些动物多糖在动物机体内不易分离及多糖的药理作用与诸多因素有关，给多糖的研究和应用带来许多的挑战，这需要相关行业的人士不断地开拓创新，共同努力。参考文献1董正之主编中国动物志软体动物门北京科学出版社,1
32、9881062谢光临,吕昌龙,洪明标等乌贼墨促凝血作用机制的实验研究J中国医科大学学报,1994,2365305313吕昌龙,洪明标,钟建国等乌贼墨对小鼠移植瘤的抑制作用J实用肿瘤学杂志,1994,81674苏伟明,马润娣,于立坚等中国枪乌贼墨汁提取物的抗肿瘤作用J中国海洋药物杂志,2005,24247505黄枚乌贼墨抗癌活性的实验研究J福建中医学院学报,2004,14123246雷敏,王静凤,李兆杰等乌贼墨制品对60CO辐射损伤小鼠造血功能的影响J食品科学,2007,2822932977FUNATSUY,FUKAMIK,KONDOHETALIMPROVEMENTOFKUROZUKURIIKA
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