1、本科毕业设计（20_届）硒化乳酸菌胞外多糖抗氧化活性研究所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录0前言11材料与方法111材料112仪器与设备213试剂214理化性质的测定2141多糖的溶解性2142多糖的鉴别与分析2143乳酸菌胞外多糖多糖成分分析31431单糖标准溶液的配制31432水解多糖样品的制备31433展开系统及显色剂的配制31434点样31435展层31436显色31437RF值的测定方法415体外抗氧化活性的测定4151对超氧阴离子自由基（O2）清除能力的测定4152羟自由基（OH）清除能力测定4153总抗氧化能力测定42结果与分析521硒化乳酸
2、菌胞外多糖理化性质的测定5211硒化乳酸菌胞外多糖的溶解性测定5212硒化乳酸菌胞外多糖的鉴别与分析52121碘碘化钾反应52122MOLISH反应52123茚三酮反应5213硒化乳酸菌胞外多糖多糖成分分析522硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对超氧自由基（O2）的清除作用62硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对羟自由基（OH）清除作用724硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖总抗氧化能力73结论8致谢错误未定义书签。参考文献92摘要本文对制备的硒化乳酸菌胞外多糖进行了理化性质及其抗氧化活性的研究。通过理化性质实验得出，它是一种溶于水，不溶于乙醇，丙酮，氯仿等有机溶剂的不含淀粉多糖的多糖；通过硒化与未经硒化乳酸
3、菌胞外多糖清除超氧自由基，羟自由基的能力以及他们的总抗氧化能力实验，得出结果，经硒化的乳酸菌胞外多糖在多糖浓度为8MG/ML时对超氧阴离子自由基清除率为6125，相比硒化前的多糖在同样浓度下对超氧阴离子自由基的清除率4174提高了1951；而在多糖浓度为8MG/ML时对羟自由基的清除率从54947提高到418，提高了1924；在多糖浓度为10MG/ML时，硒多糖的总抗氧化能力为97U/L，未经硒化的总抗氧化能力74U/L，提高了23U/L。关键词乳酸菌；硒多糖；抗氧化活性；理化性质ABSTRACTARESEARCHOFPHYSICALANDCHEMICALPROPERTIESANDANTIOX
4、IDANTACTIVITYTOSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIAINTHISPAPERTHEPHYSICALANDCHEMICALPROPERTIESEXPERIMENTSSHOWEDTHATSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIAISAPOLYSACCHARIDETHATSOLUBLEINWATERBUTINSOLUBLEINORGANICSOLVENTSLIKEETHANOL,ACETONE,CHLOROFORM,ETC,ANDISNONSTARCHPOLYSACCHARIDEST
5、HESCAVENGINGOFSUPEROXIDERADICALANDHYDROXYLRADICALANDTOTALANTIOXIDANTCAPACITYTOSELENIUMANDNONSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIAWASRESEARCHED,THERESULTSSHOWEDTHATTHESUPEROXIDEANIONRADICALSCAVENGINGRATEWAS6125INTHESELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIACONCENTRATION8MG/ML,COMPAREDTOT
6、HESCAVENGINGRATEOFNONSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIA4174INCREASED1951,WHILETHESCAVENGINGRATEOFHYDROXYLRADICALINCREASED1924FROM5494TO7418,WHENTHECONCENTRATIONOF10MG/MLINPOLYSACCHARIDE,THETOTALANTIOXIDANTCAPACITYOFPOLYSACCHARIDEINCREASED23U/LFROM74U/LTO97U/LKEYWORDSLACTICACIDBACTERIASEL
7、ENIUMPOLYSACCHARIDEANTIOXIDANTACTIVITYPHYSICALANDCHEMICALPROPERTIES10前言乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。从广泛意义上讲，这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系，具有抑菌消炎，抗氧化、抗肿瘤，降低胆固醇，提高免疫力等功效1,2。胞外多糖EX
8、OPOLYSACCHARIDESEPS是由细菌和微型藻类在生长过程中分泌到细胞外的长链多糖。EPS常常以荚膜多糖和黏多糖两种形式存在，但对于微生物来说,主要是指不与细胞表面永久粘附的黏多糖3。多糖的提取工艺在国内外的研究已经有很多4。微生物EPS具有增稠和凝胶的特性，已被用作工业中的增稠剂、凝胶剂和稳定剂。但是，乳酸菌具有公认的安全性,其产生的EPS可以替代工业微生物多糖广泛用于食品配方中。而且，大量的研究证实乳酸菌产生的EPS具有抗肿瘤活性、免疫激活作用、降低血清胆固醇和益生元作用等，对人类的健康有着重要的意义5。因此，乳酸菌EPS作为食品级生物添加剂应用于食品工业，甚至应用于医药和工业中的
9、潜力很大，认识、改造和利用乳酸菌EPS对于提升食品的质量和增加食品的功能具有重要意义。近几十年来,由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特殊优势而得到大力研究和开发,微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。由于乳酸菌是食品级工业生产菌,与其他菌相比安全性高,所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多。硒是动物和人体中一些抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶）和硒P蛋白的重要组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围的作用，研究证明具有提高动物免疫力作用，在国际上硒对于免疫力影响和癌症预防的研究是该领域的热点问题，因此，硒可作为动物饲料微量添加剂，也在植物肥料中添加微量元素肥，提高农副
10、产品含硒量。硒已被作为人体必需的微量元素，目前，中国营养学会推荐的成人摄入量为每日50250微克，而我国2/3地区硒摄入量低于最低推荐值，因此，中国是一个既有丰富硒资源，又存在大面积硒缺乏地区，这也是国际学者对中国感兴趣的原因。硒多糖是硒的一种有机存在形式，相对无机硒6而言有机硒7毒性低、副作用小，能够更好地发挥硒的生理活性8。有机硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有无机硒的多种活性，还具有多糖的各种生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被机体吸收利用9。天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，但含量较低，即使在高硒地区的富硒植物或微生物中，硒多糖中的硒含
11、量也相对较低。因此，研究者们试图通过一些富硒手段如人工协迫富硒栽培、富硒酵母培养等，使生物体中硒多糖的硒含量增加。此外，通过多糖硒化修饰或化学合成等化学方法也可以获得大量的硒多糖10。已经有不少关于硒多糖的研究，如孙兰萍，张胜义，许晖对硒化壳聚糖的研究11，张威,王敏,朱劲华等对硒化紫球藻胞外多糖的研究12，温磊，尚德静，王伟对灵芝硒多糖的研究13。但是对微生物的硒化多糖的研究还不多见。硒化乳酸菌胞外多糖是实验室人工合成的微生物硒多糖，本次实验对制备得到的硒多糖进行初步的理化性质分析及抗氧化活性研究，通过比较硒化前后乳酸菌胞外多糖的抗氧化活性，初步明确其抗氧化活性是否优于未经硒化的乳酸菌胞外多
12、糖，为硒化乳酸菌胞外多糖的开发提供理论依据。1材料与方法11材料A乳酸菌胞外多糖由实验室制备所得2B硒化乳酸菌胞外多糖将一定量的乳酸菌胞外多糖粉末放入三角瓶中，加入体积分数为05的硝酸水溶液10ML，加热搅拌使多糖全部溶解，再经水浴加热到相应的温度，加入相应量的NA2SEO3和BACL2，反应相应的时间后。冷却到室温，用NA2CO3调PH56，加入适量无水NA2SO3沉淀反应液中的氯化钡，用高速冷冻离心机下在5000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，再用无水乙醇沉淀4冰箱过夜，收集沉淀，透析24H，冷冻干燥后，即为硒多糖。12仪器与设备湘仪H2500R离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司
13、KDT23可见光分光光度计上海科登精密仪器有限公司湘仪H2050R离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司LDZX50KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂DHG9108A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司PHS3C型酸度计上海盛磁仪器有限公司电子天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司硅胶板上海信谊仪器厂WFZUV4802H型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司DK8D型电热恒温水槽上海一恒科技有限公司其他通风柜，电冰箱，移液枪，移液管，锥形瓶，试管，烧杯，电热恒温水浴锅等。13试剂总抗氧化能力（TAOC）测试盒（南京建成生物工程研究所），乙酸乙酯（天津市博迪化工有限公司），吡啶
14、（上海展云化工有限公司），苯胺（国药集团化学试剂有限公司），二苯胺（国药集团化学试剂有限公司），D木糖（上海晶纯试剂有限公司），D半乳糖（上海晶纯试剂有限公司），葡萄糖（上海展云化工有限公司），D果糖（ALADDINCHEMISTRYCOLTD），L鼠李糖（上海晶纯试剂有限公司），TRIS，邻苯三酚，浓HCL，邻二氮菲，磷酸盐，FESO4，H2O2，无水乙醇，丙酮，氯仿，NAOH，磷酸均为国产级分析纯14理化性质的测定141多糖的溶解性14多糖类物质由于其分子中含有大量的极性基团，因此对于水分子具有较大的亲和力；但是一般多糖的分子量相当大，其疏水性也随之增大；因此分子量较小，分支程度低的多糖类
15、在水中有一定的溶解度，加热情况下更溶液溶解；而分子量大，分支程度高的多糖类在水中溶解度低。多糖一般不溶于高浓度的有机溶剂。在25下将02G硒化乳酸菌胞外多糖分别溶于水，乙醇，丙酮，氯仿四种不同的溶剂中，24H后观察其溶解性。称取4份02G的硒化乳酸菌胞外多糖于事先准备好的10ML的小烧杯中，在烧杯壁上贴上标签，注明水，乙醇，丙酮，氯仿四种不同的溶剂，然后根据标签往烧杯中分别倒入四种高浓度溶剂，以倒入烧杯总量的2/3为宜。倒入后轻轻摇晃小烧杯，使多糖与溶剂充分接触，用保鲜膜封住杯口，在25放置24H。142多糖的鉴别与分析1518如果多糖遇碘变蓝，说明多糖为淀粉多糖，因此可以用碘检测多糖。取LM
16、L浓度为1MGML的硒多糖溶液加入碘碘化钾溶液，观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照，淀粉溶液1MGM1作阳性对照。3糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。取LML浓度为LMGML的硒多糖溶液，加入2滴MOLISH试剂，摇匀，将试管倾斜，沿试管壁慢慢加入LML浓硫酸，竖直试管，观
17、察浓硫酸和糖溶液交界面颜色变化。以蒸馏水作为阴性对照，淀粉溶液（1MGM1）作为阳性对照。茚三酮与氨基酸、肽类或蛋白质的自由氨基或其他氨基化合物所产生的一种可定量的显色反应。所呈现的颜色随反应的条件（酸度、温度、盐浓度、铜、镉离子等）不同而异。用于氨基酸和肽的层析及定量测定。取LML浓度为LMG/ML的硒多糖溶液，加入05ML的01茚三酮乙醇溶液，摇匀，沸水浴2MIN，冷却，观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照，05甘氨酸溶液作阳性对照。143乳酸菌胞外多糖多糖成分分析1921薄层色谱THINLAYERCHROMATOGRAPHY常用TLC表示，又称薄层层析，属于固液吸附色谱。是近年来发展起来的一
18、种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至001G）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500MG的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。1431单糖标准溶液的配制分别称取葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖，分别溶于蒸馏水中制得五种单糖标准液，浓度均为1MG/ML。1432水解多糖样品的制备称取20MG硒多糖，溶解在5ML蒸馏水中，加入12MOL
19、/L的HCL025ML，置于高压釜中，在121条件下水解4H，中和后稀释至10ML，离心。1433展开系统及显色剂的配制展开系统分别把乙酸乙酯、吡啶、无水乙醇、水按8112（V/V）的比例混合摇匀。显色剂的配制（苯胺二苯胺磷酸显色剂）2二苯胺丙酮溶液2苯胺丙酮溶液85磷酸按551（V/V）的比例混合摇匀。1434点样将葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖的单糖标准液和处理过的样品液，7种液体按顺序分别点样在薄层板上。点样量约10L，分次滴加，使点样扩散后直径不超过2MM。点样过程中用吹风机使样品干燥。1435展层将点好样品的薄层板置于密闭的层析缸中，用配制的展开剂，采用倾斜上行法，将薄层
20、板的下端浸在展开剂中0305CM，至展开剂距离薄层板的上端约1CM左右时取出自然风干。1436显色在除去溶剂后的薄层板上，均匀喷上显色剂，置于烘箱中显色，烘箱中加热显色温度一般选择85为宜，显色时间10MIN。41437RF值的测定方法被测物质在薄板上的移动速率可用比值RF值表示15体外抗氧化活性的测定2224151对超氧阴离子自由基（O2）清除能力的测定2529采用邻苯三酚自氧化法，邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化，释放出O2，生成有色的中间产物，可用分光光度法进行测定，当有清除剂存在时，O2被清除，从而阻止中间产物的积累，使邻苯三酚自氧化速率降低，表现为体系的吸光度降低，所以可通过比色法检测
21、有色中间产物的含量，进而检验待测物质清除O2的能力，因此加入一定量的具有抗氧化作用的不同浓度的多糖液可对O2产生不同的抑制作用，进而导致光吸收值的变化。配制50MMOL/LTRISHCL缓冲液（PH82），3MMOL/L的邻苯三酚溶液和不同浓度的样品溶液。取浓度为50MMOL/LTRISHCL缓冲液（PH82）45ML，加蒸馏水42ML，混匀后在25水浴保温20MIN，取出后立即加入样品2ML，蒸馏水22ML，25保温的、浓度为3MMOL/L的邻苯三酚03ML（以10MMOL/LHCL配制，空白管中以10MMOL/LHCL代替邻苯三酚溶液），迅速摇匀倒入比色杯，置于25恒温池中，在325NM下
22、每隔30S测一次；测启动后4MIN内样品抑制邻苯三酚自氧化的速率，记作V样，测空白样反应启动后4MIN内邻苯三酚自氧化的速率，记作V0。每测一个浓度配一次测样液，而且配完了就要马上测定，否则反应结束了就没法测速率了。实验结果以清除率E表示，计算公式如下E（V0V样）/V0100以清除率为依据确定有规律变化的浓度范围为最适浓度范围。152羟自由基（OH）清除能力测定3032采用FENTON体系，其原理是该物质在536NM处有吸收峰，FESO4与H2O2反应产生OH，以OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示OH的多少，吸光值越大，OH越多，如果在反应体系中加入有清除OH能力的物质，与水杨酸竞争OH，使
23、有色物质生成量减少，在536NM处测各浓度的吸光度。配制5MMOL/L邻二氮菲溶液，130MMOL/L磷酸盐缓冲液（PH74），5MMOL/L的FESO4溶液，01的H2O2溶液和不同浓度的样品溶液。取5MMOL/L邻二氮菲溶液06ML，加入浓度为130MMOL/L磷酸盐缓冲液（PH74）1ML，混匀后加入浓度为5MMOL/L的FESO4溶液06ML，充分混匀，加入样品液2ML，01的H2O2溶液04ML，摇匀，37保温60MIN，把所有样品还有两个对照管（损伤管，按照上述操作，用蒸馏水代替样品溶液，未损伤，用蒸馏水代替样品和H2O2溶液），最后以水补充至体积为5ML，配制好后，用分光光度计仪
24、器进行测定，在536NM处测定上述溶液的分光度，每测好一个就把数据记录下来。计算公式如下OH清除率（A样品A损伤）/A未损伤A损伤100以清除率为依据确定有规律变化的浓度范围为最适浓度范围。153总抗氧化能力测定采用总抗氧化能力（TAOC）测定试剂盒测定。根据（TAOC）测定试剂盒的使用说明书配置好溶液被测物质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前言至原点中心的距离RF5和不同浓度的样品溶液。根据总抗氧化能力试剂盒的要求，进行实验。计算公式如下总抗氧化能力ODUODCN/00130CPROTODU测定管吸光度值ODC对照管吸光度值N反应体积稀释倍数（反应液总体积/取样量）CPROT待测样本蛋白浓
25、度（MG/ML）以总抗氧化能力为依据确定有规律变化的浓度范围为最适浓度范围。2结果与分析21硒化乳酸菌胞外多糖理化性质的测定211硒化乳酸菌胞外多糖的溶解性测定24H后观察结果中可以看出，硒化乳酸菌胞外多糖在水中呈均匀溶解状态，说明多糖的分子量还比较小，而在乙醇和丙酮中沉于底部，在氯仿中呈漂浮状态，说明乳酸菌胞外多糖不溶于乙醇，丙酮和氯仿等有机溶剂。212硒化乳酸菌胞外多糖的鉴别与分析2121碘碘化钾反应结果表明，硒多糖溶液碘碘化钾反应呈阴性，说明不含有淀粉多糖。2122MOLISH反应结果表明，硒多糖溶液的MOLISH反应呈阳性，说明硒多糖很可能为多糖。2123茚三酮反应结果表明，硒多糖溶液
26、的茚三酮反应呈阴性。表明该物质为多糖。213硒化乳酸菌胞外多糖多糖成分分析薄层板薄层色谱法（TLC），系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值（RF）与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（RF）作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。本实验的硅胶板购自南京建成生物工程研究所，展层显色后，结果如下图1所示表1硒化乳酸菌胞外多糖的单糖组分。TABLE1THEMONOSACCHARIDECONSTITUENTOFSELENIUMEXOPOLYSACCHAR
27、IDESOFLACTICACIDBACTERIA葡萄糖鼠李糖木糖果糖半乳糖甘露糖标准品样品RF0703RF0234RF0344RF0547RF0860RF04696图1硅胶板薄层色谱。（从左至右依次为葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、水解多糖）FIG1TLCSILICAGELPLATE（FROMLEFTTORIGHTGLUCOSE,RHAMNOSE,XYLOSE,FRUCTOSE,GALACTOSE,MANNOSEANDHYDROLYSISPOLYSACCHARIDE）从表4的RF值表中可以看出，样品中出现的两个显色点的RF值为0860和0469，跟半乳糖和甘露糖的RF值一致，说明硒
28、化乳酸菌胞外多糖的单糖组分中包括半乳糖和甘露糖。22硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对超氧自由基（O2）的清除作用超氧阴离子自由基O2是在生命活动过程中起重要作用的自由基，具有很强的氧化能力，国内外学者大量研究表明一些富含多酚类、黄酮类、皂贰类、翰质类、生物碱类、多糖类等成分的天然食物有较强的抗氧化能力。经过多次实验，对比，优化，选择之后，选取浓度005，02，03，05，1，2，4，8MG/ML8个浓度的测定结果，经数据处理后得硒多糖与未硒化多糖在相同浓度范围内清除超氧自由基（O2）清除率比较结果，如下图2所示。图2硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对超氧自由基（O2）的清除作用。FIG2THESCA
29、VENGINGOFSUPEROXIDEANIONRADICALTOSELENIUMANDNONSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIA7从图2可以看出硒化乳酸菌胞外多糖和未经硒化的乳酸菌胞外多糖对超氧自由基都具有清除能力，且其清除率都随浓度的增加增强，最后慢慢变得缓和；在低浓度，约1MG/ML之前，硒化多糖的清除率比未硒化多糖的清除率有上升的趋势，随后就慢慢接近平行。当多糖浓度达到4MG/ML以上时，硒化乳酸菌胞外多糖对超氧自由基（O2）清除率可以达到50以上。硒化乳酸菌胞外多糖在选定范围内，对超氧自由基（O2）的清除率逐渐增加，最高为612
30、5，相比硒化前的多糖在同样浓度下的清除率4174提高了1951，因此，硒化的乳酸菌胞外多糖体外超氧自由基（O2）的清除能力明显增强了。23硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对羟自由基（OH）清除作用羟自由基OH是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基，经过多次实验，对比，优化，选择之后，选取浓度01，02，05，1，12，15，18，8MG/ML8个浓度的测定结果，经数据处理后得硒多糖与未硒化多糖在相同浓度范围内清除羟自由基（OH）清除率比较结果，如下图3所示。图3硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对羟自由基（OH）清除作用。FIG3THESCAVENGINGOFHYDROXYLRADICALTOSELEN
31、IUMANDNONSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIA从图3可以看出硒化乳酸菌胞外多糖和未经硒化的乳酸菌胞外多糖对羟自由基都具有清除能力，且其清除率都随浓度的增加增强，最后慢慢变得缓和，但是硒多糖的清除率始终大于未经硒化的多糖，且在低浓度，约2MG/ML之前，硒化多糖的清除率比未硒化多糖的清除率有上升的趋势，随后就慢慢接近平行，但始终要高与未硒化多糖的清除率。当多糖浓度达到12MG/ML以上时，硒化乳酸菌胞外多糖对羟自由基（OH）清除率可以达到50以上。硒化乳酸菌胞外多糖在选定范围内，对羟自由基（OH）的清除率逐渐增加，最高为7418，相
32、比硒化前的多糖在同样浓度下的清除率5494提高了1924，因此，硒化的乳酸菌胞外多糖体外羟自由基（OH）的清除能力明显增强了。24硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖总抗氧化能力许多实验证明，硒多糖能显著提高老龄小鼠体内的SOD及GSHPX活性，延缓小鼠的衰老速度，且其作用效果与硒多糖的服用剂量呈正相关经过多次实验，总抗氧化能力越高，说明多糖延缓衰老的效果越明显。经过多次实验，对比，优化，选择之后，选取浓度01，02，05，1，2，5，10MG/ML7个浓度的测定结果，经数据处理后得硒多糖与未硒化多糖在相同浓度范围内总抗氧化能力比较结果，如下图4所示。8图4硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖总抗氧化能力。F
33、IG4THETOTALANTIOXIDANTCAPACITYTOSELENIUMANDNONSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIA从图4可以看出硒化乳酸菌胞外多糖和未经硒化的乳酸菌胞外多糖对羟自由基都具有清除能力，且其清除率都随浓度的增加增强，在低浓度的情况下，硒化的多糖和未经硒化的多糖的总抗氧化活性基本持平，随着浓度的增加，特别在浓度大于05MG/ML后，硒化的乳酸菌胞外多糖的总抗氧化活性开始明显大于未经硒化的乳酸菌胞外多糖，且这种优势呈上升趋势。在多糖浓度大于2MG/ML之后，硒化乳酸菌胞外多糖的总抗氧化能力都比较强。硒化乳酸菌胞外多糖
34、在选定范围内，总抗氧化能力逐渐增加，最高为97（U/L），相比硒化前的多糖在同样浓度下的总抗氧化能力74（U/L）提高了23（U/L），因此，硒化的乳酸菌胞外多糖体外总抗氧化能力能力明显增强了。经过硒化的乳酸菌胞外多糖具有较强的抗氧化能力，抗氧化物是预防疾病的关键物质，将为心血管疾病、糖尿病、肿瘤等疾病防治带来重大革命，俨然已成为预防医学新宠，目前世界各国在制药生技业、化妆品、保健食品，甚至于一般食品，都朝此方向努力推进。3结论31通过溶解性实验得出结论乳酸菌胞外多糖溶于水，但不溶于乙醇，丙酮，氯仿等有机溶剂。32通过多糖的鉴别分析实验可以得出结论多糖溶液碘碘化钾反应呈阴性，说明不含有淀粉多糖
35、；多糖溶液的MOLISH反应呈阳性,说明乳酸菌胞外多糖可能是糖类物质；多糖溶液的茚三酮反应呈阴性,说明乳酸菌胞外多糖为多糖，不含氨基酸或蛋白类物质。33通过薄层色谱法分析多糖成分得出结论乳酸菌胞外多糖的单糖组成为半乳糖和甘露糖。34通过硒化乳酸菌胞外多糖与未经硒化的乳酸菌胞外多糖在清除超氧自由基和羟自由基的能力，以及总抗氧化能力的比较，得出结论经硒化的乳酸菌胞外多糖在多糖浓度为8MG/ML时对超氧阴离子自由基清除率为6125，相比硒化前的多糖在同样浓度下对超氧阴离子自由基的清除率4174提高了1951；而在多糖浓度为8MG/ML时对羟自由基的清除率从54947提高到418，提高了1924；在多
36、糖浓度为10MG/ML时，硒多糖的总抗氧化能力为97（U/L），未经硒化的总抗氧化能力74（U/L），提高了23（U/L）。说明硒化乳酸菌胞外多糖具有开发前景，有得到广泛开发与应用的潜在价值。9参考文献1DRAGOMIRSSONHADAMARDSINEQUALITYFORTHECONVEXMAPPINGSDEFINEDONABALLINTHESPACEANDAPPLICATIONSJMATHEMATICALINEQUALITIESANDAPPLICATION,2000,321771872王福利经典HADAMARD不等式的高维推广J数学的实践与认识,2006,3693703733DEVUYSTL
37、,DEVINF,VANINGELGEMF,ETALRECENTDEVELOPMENTSINTHEBIOSYNTHESISANDAPPLICATIONSOFHETEROPOLYSACCHARIDESFROMLACTICACIDBACTERIAJINTERNATIONALDAIRYJOURNAL,2001,116877074XIAGUO,XIANGZOU,MINSUNOPTIMIZATIONOFEXTRACTIONPROCESSBYRESPONSESURFACEMETHODOLOGYANDPRELIMINARYCHARACTERIZATIONOFPOLYSACCHARIDESFROMPHELLIN
38、USIGNIARIUSJCARBOHYDRATEPOLYMERS,8020103443495RUASMADIEDOP,HUGENHOLTZJ,ZOONPANOVERVIEWOFTHEFUNCTIONALITYOFEXOPOLYSACCHARIDESPRODUCEDBYLACTICACIDBACTERIAJINTERNATINALDAIRYJOURNAL,2002,121631716史丽英微量元素硒的测定方法综述J微量元素与健康研究,2007,24463657吴雪芳硒蛋白对心血管疾病辅助治疗的临床评价J现代生物医学,2003,4488胡群宝,郭宝江螺旋藻硒多糖对小鼠免疫功能的影响J中国海洋药物杂
39、志,2001,2051820,299黄峙,郑文杰,郭宝江含硒生物大分子化合物研究进展J海南大学学报（自然科学版）,2001,19216917510王艳预,吴海歌,高大彬等硒多糖的研究进展J化学与生物工程,2008,25279,1811孙兰萍张胜义许晖硒化壳聚糖的制备以及理化性质的研究食品工业科技,2006,272145146，15112张威,王敏,朱劲华等硒化紫球藻胞外多糖组成与结构的初步分析天然产物研究与发,2006,1896496713温磊尚德静王伟灵芝硒多糖的制备及其分离纯化中国食用菌,2005,246444614孙兰萍,张胜义,许晖硒化壳聚糖的制备及理化性质的研究J食品工业科技,200
40、6,27214515陈国梁,张金文,陈宗礼等红枣多糖提取分离工艺的优化J食品科学,2006,27314915216秀丽,吕嘉枥,肖静等昆布多糖的研究进展J安徽农业科学,2010,3827154471544817陈群银杏白果多糖的提取免疫调节作用和抗肿瘤活性研究D济南山东师范大学硕士学位论文,200018宋根平,许爱华,陈华圣等银杏外种皮多糖的成分分析J中药材,1997,20946146319DAODONGPAN,XIUMINGMEIANTIOXIDANTACTIVITYOFANEXOPOLYSACCHARIDEPURIFIEDFROMLACTOCOCCUSLACTISSUBSPLACTIS12
41、JCARBOHYDRATEPOLYMERS,80201090891420马利华,秦卫东生姜多糖抗氧化性及其组分的研究J中国食品添加剂,2010,3113118,8921孙悦,张茜,毕静文等微乳薄层色谱用于糖分离的研究J化学分析计量,2010,191747622吕丽爽天然抗氧化剂低聚原花青素的研究进展J食品科学,2002,23214723吴朝霞,吴朝晖大孔吸附树脂纯化葡萄籽原花青素的研究J食品与机械,2006,224464824赵平,宋学娟,张月萍大孔树脂对葡萄籽原花青素的吸附研究J中国中药杂志,2007,32202196220025韩少华,朱靖博,王妍妍邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究
42、J中国酿造,2009,615515726赵新合油菜和荷花峰花粉提取物的抗氧化研究J应用化学,2006,850050427刘金玲,王卫东,郭景云鲜生姜提取液抗氧化作用的探讨J河南中医,1996,16315628张海容沙棘多糖和黄酮清除氧自由基的研究J化学通报,2006,6253029赵二劳,张海容,盖青青等沙棘黄铜的测定及其抗氧化作用J化学研究与应用2003,15228428530吕丽爽脱脂葡萄籽中低聚原花青素的提取J无锡轻工大学学报,2001,2022031陈留勇,孟宪军黄桃水溶性多糖的抗肿瘤作用及清除自由基、提高免疫活性研究J食品科学,2004,25116717032程超,李伟,汪兴平平菇水溶性多糖结构表征与体外抗氧化作用J食品科学,2005,2685557
