1、本科毕业设计（20_届）鱼类嗅觉基因的SOUTHERN杂交分析研究所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录1引言12材料与方法121材料1211原料与试剂1212主要仪器2213主要试剂及其配制222方法2221实验动物的采集2222大黄鱼基因组DNA提取3223基因组DNA电泳检测及其浓度测定3224基因组DNA的酶切及电泳检测后回收3225地高辛探针制备3226电转法转膜4227预杂交及杂交5228杂交膜的洗脱5229杂交膜的显色52210拍照并记录53结果和分析531RNA提取与RTPCR532大黄鱼基因组DNA提取与限制性内切酶的酶切633大黄鱼嗅觉受体基因S
2、OUTHERNBOLT74讨论85结论9致谢9参考文献102摘要鱼类的嗅觉器官是其重要的化学感受器之一，由鼻孔、鼻腔和位于鼻腔内的嗅囊构成，鱼类嗅觉器官的进化与发展也经历了一个由低级到高级、由简单到复杂的过程。鱼类的嗅觉器官在鱼类的生活中，诸如摄食、御敌、生殖和集群等行为上发挥着重要的作用。本研究主要利用SOUTHERN印迹杂交技术检测本实验室已经鉴定出2个家族的嗅觉受体基因（OR）在基因组中分布情况，同时预测嗅觉基因在基因组的拷贝数，旨在为了解大黄鱼的嗅觉分子生理提供理论基础。关键词大黄鱼；嗅觉受体基因；SOUTHERNBLOT；拷贝ABSTRACTTHEOLFACTORYOFFISHISO
3、NEOFTHEIMPORTANTCHEMICALSENSORS,ITFORMSBYTHENOSTRILS,THENOSEANDTHESMELLOFTHESACINNASALOLFACTORYORGANS,FISHEVOLUTIONANDDEVELOPMENTALSOEXPERIENCEDAPROCESSFROMLOWTOHIGH,FROMTHESIMPLETOTHECOMPLEXTHEOLFACTORYOFFISHPLAYEDANIMPORTANTROLEINTHELIFEOFFISH,SUCHASFEEDING,FOOT,REPRODUCTIVEANDCLUSTERBEHAVIORTHISR
4、ESEARCHMAINLYUSETHESOUTHERNIMPRINTINGHYBRIDTECHNOLOGYTESTINGDISTRIBUTIONOFTWOFAMILYOLFACTORYRECEPTORGENEORINTHEGENOMEWHICHHASIDENTIFIEDINLABORATORY,ANDPREDICTINGCOPYSOFOLFACTORYGENE,FORTHEPURPOSEOFPROVIDINGTHEORETICALFOUNDATIONINORDERTOUNDERSTANDTHEOLFACTORYMOLECULARANDPHYSIOLOGICALOFTHELARGEYELLOWC
5、ROAKERKEYWORDSLARGEYELLOWCROAKEROLFACTORYGENESOUTHERNBLOTCOPYS11引言在多彩的生物界中，各种动物都具有丰富的化学感受器官，如视觉、嗅觉、味觉和触觉。其中嗅觉是动物感受外界气味、寻觅食物、与同类联络的重要器官1。其发展经历了一个由低级到高级、由简单到复杂的进化过程。其中脊椎动物的嗅觉器官与无脊椎动物相比，进化得较为完善，结构也较复杂。而对于鱼类来说，它们的嗅觉器官是其重要的化学感受器之一，由鼻孔、鼻腔和位于鼻腔内的嗅囊OLFACTORYSAC构成，在鱼类的生活诸如摄食、御敌、生殖和集群等行为上起着主要的作用24。嗅觉器官作为鱼类的重要
6、化学感受器，可以感受的刺激十分广泛，如食物的气味、地理位置和同类的识别等。对嗅觉和神经细胞生理机制的深入研究，具有重要的理论和实际意义一方面可以探讨嗅觉神经生物学、同源器官间的形态进化、嗅觉器官的功能形态学和化学信号的识别等基本理论问题；另一方面对于人工养殖的嗅觉灵敏鱼类，可以设计高效低廉的饲料配方，从而直接服务于生产57。SOUTHERN杂交是分析基因结构或检测DNA中是否含有特定序列的有效技术之一。其原理是DNA经过标准琼脂糖电泳按分子大小分离，再经原位变性，从胶上转到固相支持物上。附于膜上的DNA可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法如放射自显影或加入相应的显色
7、剂等可以确定与探针互补的条带位置。该方法是对转基因植株进行分子生物学鉴定的非常经典的方法，能在DNA水平上检测外源基因是否转入并整合到植物染色体上。SOUTHERN杂交中探针有同位素标记或非同位素标记，其中非同位素标记系统主要有地高辛标记系统和生物素标记系统。地高辛标记系统与生物素标记系统两者相比，由于地高辛一般不存在生物体中，消除了内源性背景，因而应用更为广泛。随着化学发光底物的运用与不断的改进，地高辛标记系统灵敏度也在不断增强，甚至超过放射性同位素标记系统，因而大多数实验室已将此项技术运用在转基因，分子杂交等研究方面89。但是其操作程序繁琐，对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求，
8、要获得理想杂交结果需要反复摸索。本研究主要利用SOUTHERN印迹杂交技术10检测本实验室已经鉴定出的大黄鱼两个家族的嗅觉受体基因（OR）在基因组中分布情况，同时预测嗅觉基因在基因组的拷贝数，旨在为了解大黄鱼的嗅觉分子生理提供理论基础。利用地高辛标记探针进行SOUTHERN杂交时，最常见的问题是高背景，以下两种措施可降低背景1适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；2控制地高辛抗体的浓度。SOLANAST认为使用足够量的地高辛抗体以获得较好的杂交信号，但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。一些杂交试剂盒说明书提到EB对背景有一定的影响。但是SOLANAS认为EB对背景的影响不大，SOLA
9、NAS亦采用不同量的多种DNA上样缓冲液，发现其对背景影响不大1112。2材料和方法21材料211原料与试剂1大黄鱼2工具酶AECOLIITAKARA公司BHINDIIITAKARA公司C蛋白酶KTAKARA公司DTAQTM酶TAKARA公司3主要化学试剂2A60BPDNAMAKERTAKARA公司B100KBDNAMAKERTAKARA公司CNAOH上海生物工程公司DMALEICACID上海生物工程公司EEB上海生物工程公司FHCL上海生物工程公司G琼脂糖上海生物工程公司HTRISCL上海生物工程公司INACL上海生物工程公司JEDTA上海生物工程公司212主要仪器（1）台式离心机MICRO
10、CL17，THERMO（2）电子分析天平（上海科达测试仪器厂）（3）DYY11B电泳仪（北京市六一仪器厂）（4）分子杂交炉（上海实验仪器厂有限公司）（5）涡旋振荡器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）（6）PCR仪（MASTERCLERPERSONAL，EPPENDORF）（7）凝胶成像系统（UVP，W/VISIONWORKS）213主要试剂及其配制1洗涤缓冲液（WASHINGBUFFER）01M马来酸（MALEICACID），015MNACL；加NAOH调PH至75（20OC），加03V/VTWEEN20，121OC灭菌30MIN，室温保存。2马来酸缓冲液（MALEICACIDBUFFER）01M马
11、来酸（MALEICACID），015MNACL；加NAOH调PH至75（20OC），121OC灭菌30MIN，室温保存。3检测缓冲液（DETECTIONBUFFER）01MTRISHCL，01MNACL；调PH至95（20OC），121OC灭菌30MIN，室温保存。4碱性转移缓冲液04MNAOH，1MNACL；室温下容量瓶定容至1000ML，121OC灭菌30MIN，室温保存。5中和缓冲液05MTRISHCL，1MNACL；室温下容量瓶定容至1000ML，121OC灭菌30MIN，室温保存。65TBE溶液TRIS40MM，硼酸40MM，EDTA1MM；室温下定容至1000ML，室温保存。720
12、SSC溶液30MNACL，03M柠檬酸钠；室温下定容至1000ML，121OC灭菌30MIN，室温保存。22方法221实验动物的采集2010年9月采集于浙江省宁波市象山西沪港水产养殖育苗中心，共10条，70OC冰箱保存待用。3222大黄鱼基因组DNA提取1用灭过菌的小剪刀剪取大黄鱼背上的肌肉组织于研钵（已灭菌，加有液氮）中，并不断加入液氮，用研杵研磨至粉末状；2研磨充分后转入20ML管中，用分析天平迅速称取1G组织粉末于每管，称取2管；3在超净工作台上，向每管加入15ML的组织裂解液，然后再各加入500L的蛋白酶K；将管子用保鲜膜裹紧，侧置于摇床中酶解4H；4向酶解后的组织液中各加入15ML的
13、苯酚氯仿混合液，混合均匀，12,000RPM，4OC离心10MIN；5取上清液，移至新的管中，加入145ML氯仿，充分混匀，12,000RPM，4OC离心10MIN；6取上清液，加入15ML的无水乙醇（20OC预冷），轻轻混匀，这时已可见白色絮状沉淀（即DNA），12,000RPM，4OC离心10MIN；7倒掉上清液，向管中加入1ML70乙醇（20OC预冷），混匀，12,000RPM，4OC离心10MIN，倾去上清液，在超净工作台中晾干DNA；8待干燥后，用少量无菌水溶解，待其溶解后，用移液枪轻轻地将其吸出注入到EP管中放在20OC冰箱中冷冻保藏。223基因组DNA电泳检测及其浓度测定1制电泳
14、胶称取015G的琼脂粉，将其倒入锥形瓶；再量取15ML1TAE加入到锥形瓶，用微波炉稍稍加热溶液，使琼脂粉溶解；待溶液冷却后，用移液枪加入1L的EB到溶液中，振荡混匀，然后将其倒在座胶器上（以上是制作1，15ML的胶；全过程要带EB手套，注意选择合适的座胶器以及梳子）；2电泳检测将DNA从20OC冰箱中取出置于冰上，用移液枪分别吸取3LDNA溶液与1L6LOADINGBUFFER，混匀后点样，设定电泳仪电压为80V，跑60MIN，电泳结束后，使用凝胶成像系统观察基因组DNA提取的质量，并拍照；3使用DNA浓度检测仪测定所提取的DNA的浓度。224基因组DNA的酶切及电泳检测后回收先制备如下体系
15、，将体系置于水浴锅（37OC）中酶切过夜试剂HINDIII试剂ECOLII体积/LHINDIII10MBUFFERDNA无菌水ECOLII10HBUFFERDNA无菌水121GUPTO201制备一定浓度的电泳胶（1，30ML）；2将酶切过夜后的基因组DNA溶液作为样品，从冰箱中取出DNAMAKER和6LOADINGBUFFER，用移液枪分别吸取3LDNA溶液与1L6LOADINGBUFFER，混匀后点样，DNAMAKER单独点一个样，设定电泳仪电压为80V，跑50MIN，电泳结束后，使用凝胶成像系统观察酶切的质量，拍照；3DNA回收向酶切DNA溶液中加入4L的DNAMATE溶液，混合均匀，再加
16、入25倍体积的无水乙醇（20OC预冷），充分混匀；12,000RPM，4OC离心15MIN；弃溶液，加入70乙醇（20OC预冷）1ML，轻轻上下颠倒洗涤，12,000RPM，4OC离心5MIN后弃去乙醇，真空干燥；最后用适量的无菌水溶解，置于20OC冰箱中冷冻保藏。225地高辛（DIG）探针制备41总RNA的提取TRIZOL法提取A提取组织RNA时，每50100MG组织用1MLTRIZOL试剂对组织进行裂解；B将上述组织的TRIZOL裂解液转入EP管中，在室温1530OC下放置5MIN；C在上述EP管中，按照每1MLTRIZOL加02ML氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15S，
17、在室温下（15OC30OC）放置23MIN后，12,000RPM（2OC8OC）离心15MIN；D取上层水相置于新EP管中，按照每1MLTRIZOL加05ML异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15OC30OC）放置10MIN，12,000RPM（2OC8OC）离心10MIN；E弃上清，按照每1MLTRIZOL加1ML75乙醇进行洗涤，涡旋混合，7,500RPM（2OC8OC）离心5MIN，弃上清；F让沉淀的RNA在室温下自然干燥，然后用RNASEFREEWATER溶解RNA沉淀。2反转录将反转录用的引物、DNTPMIXTURE、模板RNA混合65OC、5MIN后4OC添加5PRIMESCRIPT
18、TMBUFFER和PRIMESCRIPTTMRTASE30OC、10MIN；42OC、1530MIN；95OC、5MIN后4OC。3RTPCR将反转录反应液的一部分作为模板，进行PCR反应。温度时间循环94OC94OC5565OC72OC1MIN30S30S1MIN/KBP30CYCLES30CYCLES30CYCLES4切胶回收A琼脂糖电泳，将特异电泳带用灭过菌的刀片切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；B按照每100MG加400L的量加入BINDINGBUFFER，放入到EP管振荡器中，45OC55OC温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5MIN）；C取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中
19、，室温下放置2MIN，8,000RPM离心1MIN，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；D加500L的WASHBUFFER至柱中，8,000RPM离心1MIN。弃管中的溶液；E重复操作4步的操作一次，最后将纯化柱放入EP管中10,000RPM离心30S，除去痕量的WASHBUFFER；F将纯化柱放入一个新的EP管。加3040L无菌水或ELUTIONBUFFER至纯化柱膜的中央，在37OC或50OC下放置2MIN，10,000RPM离心1MIN洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在20OC冰箱保存。5地高辛标记探针A加入1G的模板DNA（TEMPLATEDNA）到16L的无菌水中；B将装有D
20、NA的EP管放入热水中煮沸10MIN后迅速插入冰中，使其变性；C加入4L的DIGHIGHPRIME到已变性的DNA中，轻轻混匀，37OC培养1H；D加热混合液到65OC，维持10MIN，结束反应。226电转法转膜1AGROSE电泳将酶切回收好的DNA样品电泳（电泳胶不加EB），设定电泳仪电压为70V，跑120MIN；2电泳结束后，将电泳胶放入干净的培养皿中；先用适当体积的04M的HCL处理15MIN，然后再用适当体积的碱性转移缓冲液浸泡（210MIN），期间在水平摇床上轻轻振荡，使DNA充分变性；53以05TBE溶液润洗、平衡电泳胶（210MIN）；4按照电泳胶的大小切滤纸4张，杂交膜一张，连
21、同纤维垫一起用05TBE溶液浸泡平衡；5清洗电转印装置后装板，从负极到正极依次放入纤维垫、2层滤纸、电泳胶、杂交膜、2层滤纸、纤维垫，压紧后别上开关组装成一体，按凝胶转印膜（负极正极）的方向插入转印槽中；6倒入4OC预冷的05TBEBUFFER，放入COOLINGUNIT，80V电转印2H。227预杂交及杂交1起板，将杂交膜转入一玻璃容器，置于烘箱中120OC烤膜30MIN；2预杂交预热一定体积的预杂交液（42OC），将杂交膜轻轻放入杂交管，向管中加入适当体积的预杂交液（10ML/100CM2），在杂交管中预杂交30MIN；3探针变性将装有地高辛标记探针的EP管先在沸水中煮5MIN，然后迅速插
22、入冰中，使其变性；4制备杂交液将变性的探针加入到预热的预杂交液中（35ML/100CM2），混合均匀，避免气泡；5杂交倒掉预杂交液，向杂交管中加入已配好的杂交液，使杂交液浸没杂交膜，在杂交炉中杂交过夜。228杂交膜的洗脱1用2SSC，01SDS洗膜25MIN，1525OC；2用05SSC，01SDS洗膜215MIN，6568OC（杂交炉需提前预热到65OC）。229杂交膜的显色（都是在杂交炉中洗，并且以100CM2杂交膜为例）1用适当体积的洗涤缓冲液（WASHINGBUFFER）洗膜5MIN；2制备一定浓度的封闭液（BLOCKINGSOLUTION）；3用100ML封闭液（BLOCKINGSO
23、LUTION）培养30MIN；4制备一定浓度的抗体溶液（ANTIBODYSOLUTION）；5用20ML抗体溶液（ANTIBODYSOLUTION）培养30MIN；6用100ML洗涤缓冲液（WASHINGBUFFER）洗膜215MIN；7用20ML检测缓冲液（DETECTIONBUFFER）平衡5MIN；8制备显色剂（COLORSUBSTRATESOLUTION）；9将杂交管中液体倒出，将提前准备的显色剂加入到一密闭袋子中，然后再将膜小心地移入袋子，膜杂交的一面朝外，并使显色剂浸没杂交膜。置于暗室显色过夜。附封闭液（BLOCKINGSOLUTION）将10BLOCKINGSOLUTION以11
24、0的比例稀释到马来酸缓冲液（MALEICACIDBUFFER）中；抗体溶液（ANTIBODYSOLUTION）先将ANTIDIGOXIGENINAP10,000RPM离心5MIN，以15000稀释在封闭液（BLOCKINGSOLUTION）中；显色剂（COLORSUBSTRATESOLUTION）加入200L的NBT/BCIP到10ML检测缓冲液（DETECTIONBUFFER）中。2210拍照并记录取出显色过夜后的杂交膜，观察有无条带，若有清晰条带，则可以拿去拍照，然后数出每张杂交膜上的条带数，即为该组探针在大黄鱼基因组的拷贝数。3结果和分析31RNA提取与RTPCR6利用TRIZOL的方法
25、对大黄鱼嗅觉上皮细胞进行总RNA的提取，对提取的RNA进行琼脂糖凝胶的检测，以做为评定RNA质量。图1所示，28S、18S和58S清晰可见，28S与18S的亮度比约2倍说明提取的RNA质量比较好，可以作为反转录的模板。用上述提取的RNA各3G作为反转录的模板，将其反转录成CDNA。图1大黄鱼嗅觉器官RNA的提取，图中1与2分别为平行样品，M为MARKER从图2中，我们可以观察到大黄鱼嗅觉基因RTPCR产物电泳图，获得的两个基因的片段分别为约500BP和550BP的片段。然后将上述的PCR产物割胶回收，作为地高辛标记的模板，用于两个亚家族基因的地高辛探针标记。图2用RTPCR方法扩增出A与B两个
26、亚家族的基因电泳图，M为MARKER32大黄鱼基因组DNA提取与限制性内切酶的酶切从图3中，我们可以看到大黄鱼基因组DNA为23KBP左右，电泳图的条带较为单一，说明基因组DNA提取质量比较好，序列未曾降解，可以用来SOUTHERNBLOT的酶切DNA。于是将上述提取的DNA用来作为ECOLII和HINDIII的酶切模板。各取10G用于酶切反应。图3大黄鱼基因组DNA提取的电泳图，D代表基因组DNA，M为MARKER20001000750500400100MAB20001000750500400100MAB2313094162372564125DM7从图4中，可以观察到大黄鱼的基因组DNA的酶
27、切后的结果，电泳图谱呈现弥散状分布于整个琼脂糖凝胶上，分子量为10KBP500BP之间。说明酶切效果比较好，整个基因组DNA都被切开来。图4大黄鱼基因组DNAECOLII和HINDIII的酶切后电泳图谱，E和H分别表示这两种酶，1、2分别为两组平行的基因组DNA样品，M为MARKER33大黄鱼嗅觉受体基因SOUTHERNBLOT图5为嗅觉基因亚家族A的SOUTHERNBLOT图谱，E和H分别代表ECORI和HINDIII的酶切后结果，可以数出8条条带EHME1H1E2H2M23130941623725641258图6为嗅觉基因亚家族B的SOUTHERNBLOT图谱，E和H分别代表ECORI和H
28、INDIII的酶切后结果，可以数出24条条带从以上两图我们可以看出嗅觉基因亚家族B的拷贝数要大大多于A,并且用ECORI酶切的效果也要优于HINDIII酶切效果。4讨论SOUTHERNBLOT转膜时，一开始我们使用的是向上毛细管法，最后发现效果不是很好，可能是该法不适合实验室操作。后来改用电转法转膜，发现电转效果要明显好于向上毛细管法。以前的研究已经表明转膜的方法有多种，不同的实验室可根据本实验室的实际情况选用不同的方法，即向上毛细管转移法、向下毛细管转移法、同时向两张膜转移、电转法、真空转移。MATTHEW等认为，使用电转法、真空转移法尽管能在12H可完成转膜，但转膜效果不及毛细管法，我们使
29、用真空转印装置并配合碱性转移的转膜方法，优化真空度等参数，可以将凝胶中的DNA完全转移到尼龙膜上，可省去HCL脱嘌呤，中和、变性、固定这些步骤，节省了约20H的时间，不仅大大缩短了SOUTHERN杂交时间，还可以使杂交信号增强23倍8。先前的研究已经表明OR基因集簇于脊椎动物的基因组中。在哺乳动物的基因组中，OR基因分布在18个不同老鼠染色体中，21个人类的染色体中。从斑马鱼的OR基因中，他们发现119个OR基因分布在5个主要的簇中，每个簇含14到31个基因；有2个簇在15号染色体，2个在21号染色体，1个在10号染色体，几个小的簇分别分布在8号、14号和17号染色体；还有少数的一些是单个的存
30、在。大部分亚族都是连续毗邻的，亚族成员通常享有相同的转录方向，表明在亚族中串联重复是组要的延伸机制。在预测的基因中只有约80的受体基因找到了确切的位置，还有29个还没法确定。从以前研究中的系统发生树来看，大黄鱼ORK的嗅觉受体与河豚鱼比较近，其次就是脊鱼，接着是青将鱼，而与斑马鱼与西方树蛙比较远。嗅觉受体基因与鱼类的进化历史密切相关，因为从进化关系来看大黄鱼与脊鱼、河豚鱼关系较近，而与斑马鱼与西方树蛙较远，所以OR的进化与鱼类的进化历史有很大程度上的一致性1315。从鱼类与哺乳动物完整的OR基因库的特征，提供了对OR基因进化分析的依据。值得注意的是从构建系统发生树中，斑马鱼与河魨鱼的亚族中，都
31、形成了OR基因家族H，这个家族与其他家族相比更具有趋异性。这个家族在老鼠的基因组中没法找到。从鱼类系统树中来看，他们认为这个分枝的基因代表最古老的OR基因。而黑皮质素受体基因在系统发生树的位置也可以支持这个说法。另外他们又与八目鳗的5EH9个OR序列比对，发现八目鳗（LAMPREY）的OR基因，在黑皮质素家族两侧形成了另外两个家族，其中一个是非常明确的OR家族基因家族（AG），另外一个属于外类群被认为是可疑的OR基因。上述分析更能说明了家族H应该是这个系统树的根，是受体家族的起源。然而由于八目鳗的基因组序列尚未测完，所以也只能了解了部分的祖先基因了。另外在YOSHIHITONIIMURA等人在
32、对进化动力学分析中，他们收集了斑马鱼、河魨鱼、非洲蛙、鸡、人与老鼠的OR基因构建了系统树。结果表明从鱼类到四足动物有至少9个共同祖先OR基因，所有的OR基因都可以分配到9个家族当中去，每个家族都起源于1个共同的祖先OR基因。9个家族中的8个，都找到鱼类的OR基因，但在哺乳动物中，只存在两个家族当中，由此说明了鱼类的OR基因分化更大。然而有趣的是在哺乳动物中1个家族占了90的OR基因，而这个家族基因可以在哺乳动物与鸟类中被观察到，在鱼类中几乎观察不到。非洲蛙的OR基因与鱼类的OR基因分化比较厉害，但蛙的OR基因同时具有哺乳动物与鱼类的特征16。5结论从SOUTHERNBLOT的结果我们可以看到大
33、黄鱼两个嗅觉受体基因属于多拷贝家族的基因，这个与先前其他鱼类获得的结果一致。于是我们可以推断出整个嗅觉受体家族都成多拷贝，可能用于探测各类化合物。参考文献1陈星玉中国鲤科鱼类嗅觉器官的研究J动物分类学报,1988,1321821942孟庆闻,殷名称鳐类和银鲛类嗅觉器官的研究J水产学报,1981,532092143孟庆闻,殷名称鲨类嗅觉器官的研究C鱼类学论文集,北京科学出版社,19812012094孟庆闻,苏锦祥,李婉端鱼类比较解剖C鱼类学论文集,北京科学出版社,19873273345陈星玉中国鲤科鱼类嗅觉器官的研究J动物分类学报,1988,1321821946张振玲,赵亚辉,李高岩等鱼类嗅觉器
34、官的构造和功能J生物学通报,2007,42913147郑文莲鳞科鱼类的嗅觉器官及其在分类上的意义J热带海洋,1987,611118闫新甫,李润植,苗泽伟等转基因植物M北京科学出版社,20031541939陆小平,周文军,小岛峰雄地高辛标记探针在SOUTHERN杂交分析中的技术要点J生物学通报,2003,381525310祝梅香,邹星,沈沽等转人组织蛋白酶K基因小鼠的SOUTHERN杂交鉴定J中国比较医学杂志,2005,151404211周长发,张锐,张晓等地高辛随机引物法标记探针的SOUTHERN交杂技术优化J中国农业科技导报,2009,11412312812刘立鸿,许璐,汪铠等地高辛标记探针
35、SOUTHERN印迹杂交技术要点及改进J生物技术通报,20083574913刘东,张振玲,赵亚辉等鱼类嗅觉器官的形态与生理研究进展J动物学杂志,2005,40612212814TYLERSALIOTO1,JOHNNGAITHEODORANTRECEPTORREPERTOIREOFTELEOSTFISHJBMCGENOMICS,2005,6817318615ELHASSANHAMDANI,KJELLBDVINGTHEFUNCTIONALORGANIZATIONOFTHESHOLFACTORYSYSTEMJPROGRESSINNEUROBIOLOGY,2007,682808516CHRISTINEABYRD,JOHNTJONES,JOSEPHMQUATTROETALONTOGENYOFODORANTRECEPTORGENEEXPRESSIONINZEBRAFISH,DANIORERIOJJOURNALOFNEUROBIOLOGY,1995,429445458
