1、本科毕业设计（20_届）紫菜生物肥的研制所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录摘要1引言111海藻肥的应用价值112海藻肥的应用前景113海藻肥的研究现状12材料与仪器221实验材料222实验仪器23实验方法231菌的培养232紫菜的降解233不同降解液中的还原糖含量234浸泡种子235植物叶面喷洒336降解液对植物抗逆的作用337数据的处理34结果341不同降解液中还原糖的含量342对种子的发芽率和发芽速度影响最大的浓度筛选443降解液对植物茎长、叶绿素含量的影响5431降解液对植物茎长的影响5432降解液对植物叶绿素含量的影响644降解液对植物抗逆性的影响7441
2、气孔闭合度观察7442植保素含量的测定85讨论9参考文献11摘要目的摸索出琼脂菌降解紫菜（粉）获得生物肥的最佳降解条件，并筛选出对植物生长、抗逆最有利的样品及浓度。方法经活化的琼脂菌作用于紫菜（粉）对其进行不同时间的降解，所得到的降解液以不同的浓度、不同的方式作用于农作物，通过测定农作物的发芽速率、气孔大小、叶绿素含量及植保素含量等指标，筛选出一个最佳降解条件。结果第一次发酵24H，第二次发酵36H的溶液经稀释30倍后，对植物的发芽率有较好的效果，在发芽初期，经浸泡的种子的发芽势比没浸泡过的种子的发芽势高出50；第一次发酵24H,第二次发酵36H的溶液经稀释50倍后，能显著提高植物叶片中叶绿素
3、的含量（P001）；第一次发酵24H，第二次发酵36H的溶液经稀释50倍后，作用于大豆，大豆的植保素含量也显著增高（P001）。经这种琼胶降解菌破碎紫菜的细胞壁，不仅释放出了细胞内容物，保留了海藻天然活性成分，同时获得有促植物抗逆作用的琼胶寡糖，具有促生、增产、改良土壤、抗病等特点，适用于各种作物，这种生物肥对农业的可持续发展有着重要的作用。关键词琼脂菌；降解紫菜；生物肥ABSTRACTAIMTOEXPLORETHEBESTDEGRADATIONCONDITIONSFORTHEPORPHYRAFERTILIZER,ANDTOSCREENOUTTHEBESTSAMPLESANDCONCENTRA
4、TIONSFORPLANTGROWTHANDRESISTANCEMETHODSACTIVATEDBACTERIAWEREUSEDTDEGRADESEAWEEDPOWDER,ANDTHENTHERECEIVEDDEGRADATIONSOLUTIONWASACTEDONTHECROPSINDIFFERENTCONCENTRATIONSANDDIFFERENTWAYSSELECTONEOFTHEBESTDEGRADATIONCONDITIONSBYMEASURINGTHEGERMINATIONRATEOFCROPS,STOMATALSIZE,CHLOROPHYLLCONTENTANDPHYTOALE
5、XINCONTENTANDOTHERINDICATORSRESULTSTHEPORPHYRAPOWDERWASFERMENTEDFORTWICE,THESOLUTIONFROMFIRSTOF24HANDSECONDOF36HFERMENTATIONTIMEWITH30TIMESDILUTIONSHOWEDHIGHESTGERMINATIONRATEFORPLANTS,THEGERMINATIONRATIOWAS50HIGHERTHANCONTROLTHISSOLUTIONDILUTEDFOR50TIMESCOULDSIGNIFICANTLYINCREASETHECHLOROPHYLLCONTE
6、NTOFPLANTSP001USINGTHESAMESOLUTIONDILUTEDFOR50TIMESTOTREATSOYBEAN,RESULTSSHOWEDTHATTHEPHYTOALEXINOFSOYBEANWASSIGNIFICANTLYINCREASEDP001INCONCLUSION,USINGAGARDEGRADINGBACTERIATODISRUPTTHECELLWALLOFPORPHYRANOTONLYINCREASEDTHERELEASEOFNATURALACTIVEINGREDIENTSINCELLS,PRESERVEDLOSSOFTHESEINGREDIENTS,BUTA
7、LSOOBTAINEDAGAROLIGOSACCHARIDESWHICHCANPROMOTETHESTRESSTOLERANCEOFPLANTSRESULTSINDICATETHATTHEPRODUCTWEOBTAINEDHASGROWTHPROMOTING,IMPROVESOILDISEASERESISTANCEANDOTHERCHARACTERISTICS,ANDTHISBIOFERTILIZERISSUITABLEFORVARIOUSCROPSKEYWORDSAGARDEGRADINGBACTERIAPORPHYRAFERTILIZER11引言11海藻肥的应用价值海藻肥是有机肥、化肥、生
8、物肥之后的第4代新型肥料，它能提供的全面的营养成分，不产生环境污染，还能改善土壤的性质；同时还具有化肥的速效性，增加产量，改良品质与活化土壤等相关作用；另外还能防病、治病、加强作物抗旱和抗寒等功效19。海藻生物肥被科技界誉为当今世界上唯一的人和植物都能“喝”的金津玉液，具有显著的生物功效，同时具备了目前最先进肥料的特征。其主要作用物质是天然海藻提取物，核心原料来自天然海藻，采用特殊生化工艺处理后，从海藻中提取的精华物质很好地保留了天然活性成份，具有大量的非含氮有机物，含有40余种矿物质元素以及丰富的维生素，还具有海藻中所特有的海藻多糖、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂，可以刺激植物体内
9、非特异性活性因子的产生以及调节内源激素的相对平衡1,2。这种肥料属纯天然物质，不会造成环境、人畜的损伤。海藻肥不仅减少了海洋藻类物质的浪费，另一方面也会极大的提高它们的经济效益，同时也增加了制备农作物肥料的资源，为我们的农业作出贡献，降低化学肥料对农业所遭成的污染。12海藻肥的应用前景现在在世界上许多国家都大面积推广应用海藻肥，取得了巨大的经济效益、生态效益与社会效益。目前海藻肥在黄瓜20、番茄21、辣椒22、菠菜23、大白菜24等蔬菜作物上的应用效果已有报道。孙锦等人利用中国科学院海洋研究所提供的海藻抗逆专用型增产素抗旱专用海藻肥研究海藻肥对番茄抗旱性的影响，在番茄苗期用不同浓度的海藻肥处理
10、番茄幼株,结果表明对所选用的海藻肥而言，20G/L（克/升）的海藻肥可显著提高番茄幼株的抗旱性,在土壤含水量为106的水分胁迫下，用20G/L（克/升）的海藻肥处理日光温室番茄植株，可使番茄最大节水率达到22621。2002年2003年陈灵芝等人利用兰州陇丰农产品有限公司提供KELPAK海藻肥研究海藻肥在辣椒上的应用效果，结果表明不同浓度的海藻肥对辣椒都有促进早熟、提高产量的作用，但以1000倍效果最佳22。多项研究证实海藻肥对农作物早熟、增加产量和改善品质以及在抵抗病虫害和水果保鲜等方面都具有明显的应用效果，果蔬的保存时间也得到明显延长25,26。目前海藻液体肥因具有促进作物根系发育，提高作
11、物光合效率，促进作物根系和主茎生长，提高作物产量和品质，增强作物对不良环境的抵抗能力，促进果实早熟等优点3，在一定程度上能取代化学肥料，能够保持环境和生态的稳定，对我国很多环境方面都有着深远的意义。我国有着丰富的海藻资源，海藻的产量和资源都居世界第一，对海藻肥的开发也提供了较为便利的条件。13海藻肥的研究现状中国拥有丰富的海藻资源，但在国内海藻肥的研制仅仅起始于上世纪90年代后期，起步比较晚，但目前发展速度很快。目前有多种形态但是目前市场上主要是以液体跟粉末为主，还有很少一部分是颗粒状态。海藻肥中含有的有机活性因子对刺激植物生长起着至关重要的作用，集营养成分、抗生物质、植物激素于一体1,16。
12、目前国内生产的海藻肥产品还不是很多，现阶段国外生产的海藻肥产品为了尽可能地保留海藻天然的有机成分，同时为了方便运输，采用不同的方法将海藻提取剂制成液体肥料。目前国内生产的海藻肥产品较少，主要有90年代初，北京雷力集团研制出以海洋速生褐藻为主要原料的海藻肥4，青岛明月海藻工业有限公司生产的明月海藻肥，中外合资青岛金秋农业科技有限公司生产的美奇海藻肥等5。近年来针对海藻肥的在各种作物上的应用效果，我国开展了许多的研究。国内生物肥的制备一般是以褐藻为原料，通过化学方法或酶解方法获得，目前还未曾见有关于紫菜生物肥方面的报道。22材料与仪器21实验材料绿豆（购于路林市场）；大豆（购于路林市场）；紫菜（粉
13、）；琼脂菌；2216E培养基；陈海水；TRISHCL缓冲液；纯丙酮；CACO3；石英砂；DNS试剂。22实验仪器摇床；离心机；W201D恒温水浴锅上海申顺生物科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅；电子式可调电炉南通金石实验仪器有限公司）；MULTIKEMMK3酶标仪THERMOLABSYSTEM公司；电子天平；恒温培养箱；超净工作台；振荡仪；电子显微镜。3实验方法31菌的培养按2216E培养基配方（酵母菌1G；蛋白胨5G；柠檬酸铁01G；琼脂05G；陈海水1000ML）配制培养基。并分装到两个500ML三角瓶（标记号瓶，号瓶），四个50ML三角瓶中，同时配制5个固体斜面培养基。从7冰箱中取出琼脂菌接种
14、于斜面培养基上，并放于28恒温箱中活化。活化24H后，将斜面上的菌接种在50ML三角瓶中进行摇床培养（28，120R/PPM）。24H后移到500ML三角瓶中继续摇床培养（28，120R/PPM）。32紫菜的降解琼脂菌在500ML的三角瓶中培养24H后，往号瓶中按150的比例加入经微粉碎的紫菜粉；48H后往号瓶按同样的比例加入紫菜粉。，号瓶加入紫菜后继续摇床培养（35，120R/PPM）。培养24H后，把，号瓶取出并煮沸灭菌，然后抽滤，弃沉淀留上清，然后把两瓶上清分装（,）,并对分装后的溶液进行高压蒸汽灭菌。按上述菌活化的方法再活化一批菌，用于对所得到的上清进行二次发酵，发酵时间如下、12H；
15、、24H；、36H。二次发酵后，对溶液中的菌进行灭活，这时得到的降解液就是所要的紫菜生物肥，保存在4冰箱待用。33不同降解液中的还原糖含量用DNS比色法测其还原糖含量，具体操作如下取待测样品和对照（蒸馏水）各1ML，分别加入3ML的DNS试剂，沸水煮沸15分钟显色，冷却后用蒸馏水稀释至25ML，用72型分光光度计比色（550NM），以对照液调零点。用预先以葡萄糖做好的标准曲线即可计算出样品中糖的含量。34浸泡种子把上述不同条件下得到的降解液配制成不同的浓度，用于浸泡种子，然后观察种子的发芽速度和发芽率，筛选出对种子发芽速度和发芽率效果最佳的一个浓度用绿豆做为实验材料，将不同条件下得到的降解液配
16、制成不同浓度的溶液，将处理过的绿豆种子浸泡于溶液中24H，然后将绿豆种子移植到土壤中（由于绿豆本身也较好发芽，放在培养皿中催芽没有明显效果，所以本实验中是把种子放在溶液中浸泡24H，而后移植到土壤中，观察其出土速度）；用蚕豆作实验材料，将所得到的降解溶液配制成10100倍的浓度，然后把处理好的蚕豆种子浸泡于各溶液中24H，到时间后，把经浸泡的种子移到放有脱籽棉的培养皿中，置于25的培养箱中催芽。35植物叶面喷洒植物的培养外界温度下，在曹光虝科技楼顶种植绿豆，早晚各浇水一次，待用。将上述不同条件下得到的降解液稀释成0100倍的溶液，喷洒于已长出两片真叶的植物，用蒸馏水喷洒作为空白对照，一周后进行
17、第二次喷洒，二次喷洒7天后测量各植株茎长和并测定各植株的叶绿素含量，对其进行比较，进而3筛选出对植物生长、叶绿素含量影响最佳的一个浓度。植物的茎长的测量在二次喷洒植物7天后用测量尺测量每株植物的茎长度，求其平均值。叶绿素测定方法取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取05G，放入研钵中加纯丙酮5ML，少许CACO3和石英砂，研磨成匀浆，再加入80丙酮5ML，将匀浆转入离心管，并用适量80丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃去沉淀，上清液用80丙酮定容到10ML。取上述色素提取液05ML,加80丙酮45ML，稀释后转入比色杯中，以80丙酮为对照，分别测663NM，645NM处的光密度值。36
18、降解液对植物抗逆的作用本实验通过观察绿豆叶片气孔的闭合度和大豆的植保素含量来筛选出对植物抗逆性能影响较好的降解液浓度。具体方法如下取叶片，用蒸馏水洗净，撕下表皮，洗去叶肉细胞后，切成5MM长的表皮条，培养在TRIS缓冲液（10MMOL/LTRIS,50MMOL/LKCL,PH61）中，在23下光照2H，使气孔完全张开。从缓冲液中取出表皮条，置于不同浓度的溶液中培养45小时，在显微镜下观察气孔的闭合程度，每个处理3个表皮条，每个表皮条取3个视野，测3个气孔开度，每个重复3次。植保素测定方法先用大量蒸馏水冲洗大豆表面，用于清除掉杂质和灰尘，接着用1高锰酸钾浸泡处理2030MIN进行灭菌，再用无菌水
19、冲洗大豆表面至干净为止，在暗室下震荡24H，倒出无菌水，将吸涨的种子铺在有滤纸的搪瓷盘中，将湿纱布与滤纸和水相连，25下培养，光照为10H/D，当大豆展出两片真叶（大概8天时间）后即可用子叶进行生物活性测定。测定时剪下子叶，用1高锰酸钾灭菌610MIN，用无菌水冲洗3次，用灭过菌的滤纸将子叶表面的水分吸干，在下表皮用无菌刀片在超净工作台中切下16MM的子叶表皮，无菌水浸泡20S，吸干水分，放在铺滤纸的培养皿中，每个放10片作为一组，将样品（100UL滴加在伤口上，于黑暗条件在25培养,24H后将10个子叶转移到含有10ML去离子水的大试管中震荡30S，然后测定溶液在286NM的吸光值，用其吸光
20、值来表示其诱导产生植保素的相对含量。37数据的处理以上实验均重复做3次，所有数据以均值标准差（XS）表示。组间比较用T检验，以P005为显著差异，P001为极其显著差异4结果41不同降解液中还原糖的含量用DNS比色法求出的所得不同降解液中的还原糖含量如下表1不同降解条件下所得降解液的还原糖含量发酵条件一次发酵24H（）一次发酵36H（）二次发酵12H（）二次发酵24H（）二次发酵36H（）二次发酵12H（）二次发酵24H（）二次发酵36H（）平均含量（MG/ML）022600027019800029030900008017700049024700122026000024从表1可以看出瓶中的降解
21、液（一次发酵24H,二次发酵36H）所含的还原糖含量较其他组高，达到了0309MG/ML。42对种子的发芽率和发芽速度影响最大的浓度筛选经浸泡24H后的绿豆种子移置到土壤的第三天观察，第一次发酵24H，第二次发酵36H后的母液配制4的30倍溶液的发芽势为30，比阴性对照组的15高出50，第七天观察其发芽率为85，比水的70高出15个百分点（图1）。图1降解液对绿豆发芽影响的筛选降解液对蚕豆发芽影响的筛选，观察其发芽势、测量芽长。表2蚕豆发芽第三天的发芽个数（个）10倍20倍30倍40倍50倍60倍70倍80倍90倍100倍水46824436233346221512545345641334534
22、33844856841433476662127342622注33表示3个已出芽，3个欲出芽；22表示2个已出芽，2个欲出芽。表3蚕豆发芽第七天所测的芽长（平均CM）10倍20倍30倍40倍50倍60倍70倍80倍90倍100倍2993894102793263502683002263773344082532802202102831802832371802161881712562282031372192052782102822671462152863403283343203874003231832331411843892943243601431402011823123542702605图2蚕豆经水
23、浸泡和经水浸泡后催芽效果比较从以上两个实验中可以得出结论一次发酵24H，二次发酵36H的溶液稀释30倍后对种子的发芽影响较大，能很好的促进种子的发芽。43降解液对植物茎长、叶绿素含量的影响431降解液对植物茎长的影响（图3）00020040060080010001200140090倍70倍50倍70倍70倍20倍水图3不同条件下所得的降解液对植株茎长的影响注图中表示P005，表示P001（下同）从图3中，我们可以看出70倍（一次发酵24H，二次发酵36H的溶液稀释70倍）、50倍（一次发酵24H，二次发酵36H的溶液稀释50倍）的溶液对植物茎长的影响极其显著（P001）。这在一定程度上可以表明
24、,紫菜生物肥作用于植物后，能促进植物的生长。432降解液对植物叶绿素含量的影响首先将,六瓶溶液均稀释成0100倍的溶液，用上述方法喷洒于植物上，从各种溶液中筛选出一个最佳的稀释浓度。然后对从各溶液中筛选出的最佳浓度再次做实验进行比较，并用水作对照，再一次对这六个浓度作筛选，所得的结果表明第一次发酵24H，第二次发酵36H的溶液经稀释50倍后，喷洒于植物后，植物叶绿素A、B的含量较阴性对照组均有极显著增加（P001）（图35）。6CAMG/L127OD663269OD645CBMG/L229OD645468OD663CTMG/LCAMG/LCBMG/LCHL总含量（MG/GFW）CTMG/L10
25、5/10000102注CA表示叶绿素A的吸光值；CB表示叶绿素B的吸光值；CT表示总叶绿素的吸光值；CHL表示总的叶绿素含量。00005010015020025090倍70倍50倍70倍70倍20倍水图4不同条件下所得的降解液对叶绿素A含量的影响00001002003004005006007008090倍70倍50倍70倍70倍20倍水图5不同条件下所得的降解液对叶绿素B含量的影响700005010015020025030090倍70倍50倍70倍70倍20倍水图6不同条件下所得的降解液对叶绿素总含量的影响44降解液对植物抗逆性的影响441气孔闭合度观察图7气孔完全打开，未经降解液浸泡前8图8
26、经一次发酵24H，二次发酵36H的30倍溶液浸泡后气孔的闭合情况置于不同浓度的溶液中培养45小时，在显微镜下观察气孔的闭合程度，每个处理3个表皮条，每个表皮条取3个视野，测3个气孔开度，每个重复3次。气孔已打开的表皮在不同浓度的溶液中浸泡45个小时后，再在显微镜下观察其气孔的开闭，并用IPP51显微图片处理软件对其进行处理，所得到的结果（表4。表4经溶液处理后，气孔的关闭的程度10倍20倍30倍40倍50倍60倍70倍80倍90倍100倍3844235926255662632452883010281451842545552644547253103723084565064836354065775
27、274212536454437经数据处理得知，经30倍溶液浸泡，气孔闭合度达到了480，效果较为明显。442植保素含量的测定本实验对其进行了两次筛选，第一次筛选得出几个较好的浓度，然后在同一环境中对其进行二次筛选，根据ALBERSHEIMP等人的方法稍作修改,测定286NM下A值来表示大豆植保素的含量，所得到的结果如下900000501001502002503003504004530倍50倍30倍50倍30倍50倍30倍50倍3050水图9经不同浓度溶液处理的大豆的植保素含量通过表6分析得出，一次发酵24H，二次发酵36H的溶液经稀释50倍后的溶液对植物抗逆性的影响较为显著（P001）。5讨论
28、通过对以上几个指标的筛选，可以得出以下结论一、一次发酵24H、二次发酵36H的溶液稀释30倍后浸泡植物种子，对植物的发芽势有较乐观的效果，能提高植物发芽率，这在农业生产中有着重要意义；二、一次发酵24H，二次发酵36H的溶液稀释50倍后，在植物生长的一定时期喷洒于植物叶面，对植物茎的伸长有着积极的作用，并能显著增加植物叶面中的叶绿素含量，由于叶绿素在植物光合作用中起着吸收光能、传递光能的作用，故叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定的范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高，另外，叶绿素的含量也是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的
29、含量与组成，并因之影响植物的光合速率，因此在植物的生长过程中测定叶绿素含量，对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义；三、一次发酵24H，二次发酵36H的溶液稀释50倍后作用于植物，能显著提高植物中植保素的含量，它的产生和积累是植物抗逆机制的重要表现之一，是植物受到病原或激发子刺激后产生抗性的重要指标，能够反映外源刺激物的生物活性。因而可以通过检测植物受寡糖刺激后产生植保素的含量来表示外源刺激物对植物抗逆性能尤其是抗病诱导能力的大小。植物的抗病性越强，植保素产生的越快，积累的越多，由此在一定程度上我们可以确定紫菜生物肥在植物抗逆方面有着较好的应用前景。10参考文献1秦青,张文举,张涛海藻有机肥的
30、研究进展J中国农学通报,2001,17146492ILSEFOISSNER,DAVIDWENDEHENNE,CHRISTIANLANGEBARTELSETALINVIVOIMAGINGOFANELICITORINDUCEDNITRICOXIDEBURSTINTOBACCOJCROPPROTECTION,2000,2368178243许加超,单俊伟,刘铁玲,等海藻精肥的生产工艺中国发明专利CN1513815A4刘庆年,李红梅,曹洪涛阿卡迪安海藻对马铃薯幼苗生长和薯块产量的影响J中国蔬菜2008,231325马英杰,钟鸣株芘降解菌的培养条件优化及特性研究J现代农业科学,2008,15337396袁
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