1、本科毕业设计（20_届）组胺降解菌PSYCHROBACTERSP的生理生化与分子鉴定所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录0引言11材料与方法111实验材料1111菌株来源2112培养基2113实验试剂3114实验主要仪器4115其他412实验方法4121生长曲线和产酶曲线绘制4122形态鉴定革兰氏染色5123生理生化鉴定5124分子鉴定62结果与讨论921形态特征922生长曲线与产酶曲线特征1023生理生化特征10231生长条件实验10232生化鉴定结果1224分子鉴定结果13241DNA提取结果13242基因克隆检测结果14243目的基因测序结果14244经
2、BLAST序列比对绘制系统发生树143结论15致谢错误未定义书签。参考文献15附录16摘要组胺是生物产生的一种生物胺，存在于多种食物中，尤其是富含组氨酸的鱼类中，如金枪鱼和鲭鱼。组胺中毒事件频发，给人类健康和社会经济效益带来很多危害。为了降低鱼类食品组胺含量过高危险，提供食品加工业组胺降解菌候选菌株，本文对实验室筛选得到的组胺降解菌株进行了生理生化以及分子鉴定。此菌株为革兰氏阴性细菌，ZOBELL2216E培养基平板培养菌落呈黄色、圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，光学显微镜检下菌株为直杆状，无芽孢生成。经生理生化鉴定该组胺降解菌为嗜温、中度嗜盐、中性、需氧异养型微生物。不能分解明胶，亦不能水解淀
3、粉。氧化发酵实验中，可利用葡萄糖产酸但不产气，不能利用甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、阿拉伯糖和苦杏仁苷。可利用柠檬酸盐，硝酸盐还原阳性，硫代硫酸钠为阴性。可利用精氨酸，不能利用赖氨酸、鸟氨酸和脲素。MR阴性，VP阴性，过氧化氢酶阳性。经分子鉴定该组胺降解菌属于PSYCHROBACTERSP并与PSYCHROBACTERCIBARIUS亲缘关系最近。关键词组胺降解菌；生理生化鉴定；分子鉴定ABSTRACTHISTAMINEISABIOGENICAMINETHATOCCURS,TOVARIOUSDEGREES,INMANYFOODS,PARTICULARLYINHISTIDINERI
4、CHFISHES,SUCHASTUNAANDMACKERELNOTONLYISHISTAMINETOXICITYTOHARMHEALTH,BUTALSOISHARMFULTOSOCIALECONOMICBENEFITSINORDERTOREDUCETHEHISTAMINEQUANTITYOFTHEFISHANDPROVIDEFOODPROCESSINGINDUSTRYWITHHISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAINS,THEPAPERONTHEPRODUCTIONOFAMYLASE,HISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAIN,WEREBIOCHEM
5、ISTRYANDMOLECULEIDENTIFIEDTHECELLSOFTHEHISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAINAREGRAMNEGATIVEZOBELL2216ECOLONYISYELLOWANDROUND,ANDTHESURFACEOFTHESTRAINISMOISTANDSMOOTHWHATSMORE,THEEDGEISNEATTHESHAPEOFSINGLECELLISPOLEANDHASNOENDOSPOREUNDERTHELIGHTMICROSCOPEBYDOINGBIOCHEMISTRYIDENTIFICATION,WECANKNOWTHESTRAI
6、NISWILLGROWVERYWELLINAWARM,SALTY,OXYGENOUSANDNEUTRALCONDITIONINADDITION,WECANSEETHESTRAINCOULDMAKEUSEOFGLUCOSETOPRODUCEACIDBUTGAS,BUTITCANNOTUSEMANNITOL,INOSITOL,SORBITOL,RATLEESUGAR,SUCROSE,DENSETWOSUGAR,ARABORAMYGDALINGELATINTESTANDSTARCHTESTARENEGATIVEBUTCATALASETEST,THEUSEOFCITRATETESTANDNITRATE
7、REDUCTIONTESTAREPOSITIVE,YETSODIUMTHIOSULFATEISNEGTIVETHEBACTERIACANAVAILABLEUSEARGININEBUTCANNOTUSELYSINE,ORNITHINEORTHIOUREAONTHECONTRARY,THEMRANDVPISNEGATIVEMOREOVER,THROUGHTHEMOLECULEIDENTIFICATION,WECANSURETHESTRAINBELONGSTOPSYCHROBACTERSPANDISTHECLOSESTRELATIONSHIPWITHPSYCHROBACTERCIBARIUSKEYW
8、ORDSHISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAINBIOCHEMISTRYIDENTIFICATIONMOLECULEIDENTIFICATION10引言组胺（HISTAMINE，2咪唑基乙胺）是生物产生的一种生物胺，存在于多种食物中，尤其是富含组氨酸的鱼类中，如金枪鱼和鲭鱼，也存在于发酵食品中，如发酵香肠、奶酪、红酒、味噌和发酵咸鱼中。健康人类食物中摄取的组胺可被胺氧化酶迅速分解，但是个别胺氧化酶活性低的人会引发组胺中毒。由于二胺氧化酶活性的降低和过量的组胺使组胺降解活性降低，引起众多类似过敏症状的反应。组胺中毒是食品安全事故中高频的事故，并且涉及的人数较多。除此之外一
9、些加工制品组胺含量超标的案例也屡见不鲜，与此同时，组胺在水产品行业的研究一直是热点。目前，我国关于组胺的检测方法的和鲭鱼中组胺中毒的流行性病学等方面已有相关报道。譬如曾艳、范青霞、李青等人分别报道了近年来因食用鲭鱼类而的中毒的案例13。还有多篇文献报道了分析检测组胺的多种方法，这些研究主要涉及腌制、鱼粉等不同的样品47。国外对组胺的相关研究包括组胺的萃取、分离、检测、分析和形成机理等方面8。在水产品生产储藏过程中组胺一经形成，一般加工手段不能将其分解，所以其控制技术的研究主要在加工前、中、后的过程中物理、化学和生物保藏手段。通过抑制腐败微生物的生长和繁殖，尽量减少游离氨基酸的生成，并避免形成氨
10、基酸脱羧酶的最适反应条件来尽量避免组胺的生成。如添加溶菌酶制剂可抑制腐败微生物的生长繁殖，添加茶多酚可与鱼肉中的相关辅酶金属离子螯合抑制蛋白酶的分解速度，添加葡萄糖氧化酶制剂通过除氧抑制部分好氧腐败微生物的生长等8。此外，高盐环境可抑制大部分细菌的脱羧反应，而其它常规手段如罐装、真空包装过程的消毒等措施对组胺的抑制或去除并无明显作用9,10。除上述组胺的间接控制技术外，还可以应用组胺的微生物降解技术，并将其应用于水产制品的生产过程。组胺降解酶类主要有组胺氧化酶和组胺脱氢酶，其中，组胺氧化酶可催化组胺氧化生成醛，而组胺脱氢酶可催化组胺在氧化脱氢的同时脱去氨基生成咪唑乙醛。组胺氧化酶在高等生物体中
11、较丰富，也存在于植物组织和微生物中。目前，从水产品及其它自然界来源分离到一些具有组胺降解潜力的菌株，如WANAPORN等从腌制水产品中分离到1株产组胺氧化酶的嗜盐古细菌（NATRINEMAGARIBCC24369），DAPKEVICIUS等从鱼下脚料青贮饲料中分离筛选到5株产组胺氧化酶的乳酸菌（LACTICACIDBACTERIA），RENATA等从各种发酵食品菌群中筛选到具有组胺氧化酶活力的多个菌株，包括27株乳酸菌、17株微球菌（MICROCOCCUSSP）和21株扩展短杆菌BREVIBACTERIUMLINENS等11,12。利用微生物来控制水产品中的组胺含量，具有生物反应的一般优点，如
12、作用条件温和、反应迅速、安全可靠、节约能源等。浙江省是中国沿海省区，海产品资源丰富，拥有众多的涉渔企业，除了发酵水产制品外，多年来的水产品进场交易量、交易额、海洋渔业产值和出口额等均居全国前列。以水产品加工与出口较多地区宁波和舟山区域为例，累计水产加工企业达330多家，出口水产品贸易额2008年为418亿美元。组胺问题的存在，对各种系列水产制品，特别是低值鱼加工利用产品、青皮红肉鱼为加工原料的产品、包括发酵水产品，均有一定程度的经济上的负面影响。譬如宁波当地以易产生高含量组氨的马鲛鱼和鲐鯵鱼为原料生产的产品，因为组胺含量超标而被禁止出口的产品每年都多达五六批次。可见，微生物组胺降解机制和控制技
13、术的研究，不仅能避免含组胺水产品引起的食物中毒，从而确保水产品的食用安全，还能促进水产品进出口贸易的发展，是我省乃至整个水产品加工行业亟待解决的问题。本文对实验室筛选出的具有降解组胺能力的菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定13，为食品生产工业降低组胺含量等技术提供候选菌株。1材料与方法11实验材料2111菌株来源从鲭鱼皮肉样品中实验室筛选T6菌株、保藏。112培养基1121ZOBELL2216E培养基（G/L）蛋白胨50G酵母膏10G磷酸铁001G蒸馏水1000MLNACL25G琼脂16G最终调节PH7002，121灭菌20MIN；1122生理生化鉴定培养基（1）明胶水解实验培养基明胶1
14、2G蛋白胨05G生理盐水100ML最终调节PH7274，分装到试管中，每管装45CM高培养基，121灭菌20MIN；（2）淀粉水解实验培养基可溶性淀粉02G蛋白胨LG牛肉膏03GNACL05G生理盐水100M1最终调节PH7274，固体培养基加琼脂15G，121灭菌20MIN，然后倒平板；（3）葡萄糖的氧化发酵实验培养基葡萄糖LG蛋白胨02G琼脂06GKH2PO4002GNACL05GL溴百里酚蓝水溶液03ML生理盐水100ML最终调节PH6870，分装于试管中，121灭菌20MIN后备用，溴百里酚蓝溶液先用少量95乙醇溶解，然后加水配成1浓度溶液；（4）柠檬酸盐培养基柠檬酸钠02G琼脂2GM
15、GS047H20002GNH4H2P040LGKH2PO43H2001GNACL05GL溴百里酚蓝水溶液1ML生理盐水100ML以上成分除指示剂外加热溶解，调节PH6869，再加入指示剂，培养基分装试管，121灭菌20MIN后摆成斜面，溴百里酚蓝先用少量95乙醇溶解后再加水配成1浓度；（5）硝酸盐还原实验培养基KNO301G蛋白胨LG牛肉膏03GNACL05G生理盐水100ML最终调节PH7274，分装于试管中，121灭菌20MIN；（6）甲基红MR实验和VP实验培养基葡萄糖05G蛋白胨05GNACL05G生理盐水100ML最终调节PH7072，分装于试管中，每管装45CM高液体，121灭菌2
16、0MIN。1123分子鉴定培养基（1）LB液体培养基酵母膏15G蛋白胨075GNACL075G3蒸馏水150ML最终调节PH70，121灭菌20MIN；（2）LB固体培养基酵母膏15G蛋白胨075GNACL075G蒸馏水150ML琼脂粉24G最终调节PH70，121灭菌20MIN；（3）含氨苄青霉素的LB固体培养基酵母膏15G蛋白胨075GNACL075G蒸馏水150ML琼脂粉24G100G/MLAMP100L最终调节PH70，121灭菌20MIN。113实验试剂1131形态鉴定用溶液（1）革兰氏染色结晶紫染液；卢戈氏（LUGOL）碘液；95乙醇溶液；番红复染液14。（2）调PH所用的酸碱溶液
17、1MOL/L的盐酸溶液；01MOL/L的盐酸溶液；1MOL/L的氢氧化钠溶液；01MOL/L的氢氧化钠溶液。1132组胺浓度测定用溶液组胺二盐酸盐HAAR,美国SIGMA公司；OPAAR,国药集团化学试剂有限公司；甲醇AR,西安化学试剂厂；其他试剂均为分析纯；所用水均为MILLIPORE去离子水。1133分子鉴定用溶液（1）DNA提取试剂细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司，中国）。（2）琼脂糖凝胶电泳试剂1）LDNA/HINDIII分子量标准2）40MMOL/LTRIS乙酸1MOL/L3）溴酚蓝指示剂点样缓冲液4）琼脂糖5）1MG/ML溴化乙锭溶液（EB）6）TAE电泳缓冲液571
18、ML冰醋酸，242GTRIS碱，10ML05MOL/LEDTAPH80，用蒸馏水定容至5000ML。（3）PCR扩增试剂引物16SF53AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物16SR53CCGTCAATTCCTTTRAGTTT；模板DNA，TAQ聚合酶（25U/L，TAKARA公司，日本），MG2，4DNTP，10缓冲液，T1THERMALCYCLER（BIOMETRA，德国），无菌双蒸馏水。（4）DNA割胶回收试剂琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN公司，中国）（5）感受态细胞制备试剂4100ML01MOL/LCACL2溶液称取11G无水CACL2，溶于蒸馏水定容至100ML，
19、装于250ML三角瓶中。（6）DNA克隆试剂PLASMIDMINIPREPKITI（OMEGABIOTEK公司）、PMD19TVECTOR（TAKARA公司，日本）114实验主要仪器AB204S型分析电子天平广州君达仪器公司CARY100紫外/可见分光光度计美国瓦里安公司立体式压力蒸汽灭菌器上海中安医疗器械厂HWS智能型恒温恒湿培养箱宁波江南仪器厂F95荧光分光光度计上海合利仪器有限公司PN2123XB恒温培养摇床上海智城分析仪器制造有限公司HH3数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器场DHG9070A型电热恒温鼓风干燥箱宁波江南仪器厂ANKETDL802B离心机上海安亭科学仪器厂115其他烧杯；
20、玻璃棒；电炉；培养皿；试管；锥形瓶；量筒；接种环；试管架；离心管；冰箱；光学显微镜；酒精灯；PHS2C酸度计；计时器；移液枪（1L、10L、100L、200L、1000L、1ML）；枪头（10L、200L、1000L、1ML）；DYCZ28A型水平电泳槽；DDY1118型电泳仪；小型EP管离心机；微波炉；透射紫外观察仪；无菌操作台。12实验方法121生长曲线和产酶曲线绘制摇瓶发酵培养基中（250ML三角瓶中装入50ML），以2的接种量接种，28摇瓶培养，120R/MIN，每隔6小时取样3ML，立即放入冰箱中贮存。用未接种的培养基作空白对照，各样品取05ML加25ML蒸馏水混匀后，620NM波长
21、下比浊测定15。从最早取出的培养液开始依次测定，根据菌液的浊度来判断菌体的生物量。同时测定发酵液中组胺降解酶活力。1211组胺测定方法组胺荧光检测法（参照AOAC97713）配制901106MOL/L组胺二盐酸盐（HA）标准溶液相当于167G/ML,取1MLHA,加01MOL/LHCL1ML,然后加入04MOL/LNAOH溶液05ML,混匀后立即加入01OPA甲醇溶液01ML,混匀置室温下反应10MIN,加05ML05MOL/LHCL终止反应。所得反应产物置于荧光分光光度计中进行测定激发波长和发射波长分别为347NM和442NM。溶液配制方法1HA标准溶液贮备液1000G/ML。无碱性。准确称
22、取约1691MG组胺2HCL98于100ML容量瓶中，用01MHCL溶解并稀释到刻度，每周新配。2中间溶液10G/ML。吸取1ML贮备液放进100ML容量瓶，用01MHCL稀释到刻度，每周新配。3工作溶液01、02、03、05、10、15G/M1。吸取1、2、3、5、10、15ML中间溶液，分别于100ML容量瓶中，各用01MHCL稀释至刻度，每天新配。1212组胺降解酶活力测定取1MLHA溶液于试管中，加入05ML菌液与05ML无菌水，混匀。空白对照用05ML无菌培养基代替试验组菌液，混匀。30水浴加热1015MIN后，加01MOL/LHCL1ML,然后加入04MOL/LNAOH溶液05ML
23、,混匀后立即加入01OPA甲醇溶液01ML,混匀置室温下反应10MIN,加05ML05MOL/LHCL终止反应。所得反应产物置于荧光分光光度计中进行测定激发波长和发射波长分别为347NM和442NM。酶活单位定5义为每毫升发酵液使上述反应液在LMIN内组胺减少1G所含的酶的量为一个酶活单位EA,U/ML。酶活力U/MLOD13291N/（01697T）式中OD422NM荧光值的变化T反应时间MINN发酵液稀释倍数122形态鉴定革兰氏染色（1）制片取一洁净载玻片，用滴管滴一滴无菌水，用接种环挑取少量6号菌株的菌苔，于水滴边缘轻轻，自然风干，干燥和固定。（2）初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，
24、染色12分钟后倾去染液，水洗至流出水无色。（3）媒染用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖约1分钟，倾去碘液，水洗至流出水无色。（4）脱色用吸水纸将载玻片上的残留水吸去，滴加95乙醇液脱色约2030S，当流出液无色时立即用水冲净乙醇。（5）复染用吸水纸将载玻片上的残留水吸去，用蕃红液染12分钟，水洗去蕃红，吸去水风干。（6）镜检用显微镜油镜观察涂片，菌体呈蓝紫色为革兰氏染色阳性，呈红色为革兰氏染色阴性。123生理生化鉴定1231生长条件试验（1）温度分别挑取一环新鲜斜面种子，接种至斜面，分别在5、10、20、30、40、50下培养2D。（2）氧气ZOBELL2216E培养基（0205的琼脂），
25、用接种针挑取新鲜斜面种子穿刺接种，27培养2D。（3）PH挑取一环新鲜斜面种子，接入液体种子培养基中（20ML/100ML三角瓶）。28，160R/MIN培养24H，取05ML种子液接入PH值分别为4、5、6、7、8、9、10的摇瓶发酵培养基中（30ML/250ML三角瓶）。28，160R/MIN培养24H后。取样05ML，加25ML蒸馏水混匀后于620NM下比色。（4）盐度挑取一环新鲜斜面种子，接入液体种子培养基中（20ML/100ML三角瓶）。28，160R/MIN培养24H，取05ML种子液接入NACL浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8的摇瓶发酵培养基中（30ML/250ML三
26、角瓶）。28，160R/MIN培养24H后。取样05ML，加25ML蒸馏水混匀后于620NM下比色。1232生化鉴定（1）明胶水解试验将菌株接种于明胶水解试验培养基中，做两组平行试验和一组不接菌种的空白对照，28下培养2D。然后放入4冰箱中，观察培养基是否会凝固。不能凝固则明胶水解为阳性，凝固则为阴性。（2）淀粉水解试验取菌株点种于淀粉水解试验培养基平板上，做两组平行试验和一组不接菌种的空白对照，28下培养2D。待菌落形成后，在平板上滴加卢哥尔碘液，以铺满菌落周围为宜，平板呈蓝色。观察菌落周围是否有无色透明圈，若有，则说明淀粉被水解。（3）葡萄糖的氧化发酵试验以1824H的菌株的幼龄菌种，穿刺
27、接种于葡萄糖的氧化发酵试验培养基中，做两组平行试验和一组不接菌种的空白对照，28下培养2D。然后取出观察结果，与对照组对比看实验组中是否产酸和产气。若产气，则在琼脂柱内会产生气泡。6（4）柠檬酸盐的利用取1824H的菌株的幼龄菌种接种于SIMMONS氏培养基斜面上，做两组平行试验和一组不接菌种的空白对照，28下培养2D。然后取出观察培养基为碱性则蓝色为阳性，不变则为阴性。（5）硝酸盐还原试验将菌种接种于硝酸盐液体培养基中，做两组平行试验和一组不接菌种的空白对照，28下培养2D。然后取两洁净试管倒入少许培养液，分别各加一滴硝酸盐还原试剂甲液和乙液，对照管同样加试剂。若培养液变橙色、棕色、粉红色或
28、玫瑰红色时表示有亚硝酸盐存在，则为硝酸盐还原阳性，若无，则为阴性。（6）甲基红MR试验将菌株接种于甲基红MR试验培养基中，做两组平行试验和一组不接菌种的空白对照，28下培养2D。然后在培养液中加入几滴甲基红试剂，对照管同样加试剂。观察培养基颜色变化，若呈现红色，则甲基红试验为阳性，黄色则为阴性。（甲基红变色范围为PH44红色PH60黄色）（7）甲基乙酰甲醇VP试验接种T6菌株于VP试验培养基中，接两管做平行实验，同时还要有不接种的作对照，27下培养2D后取出。取培养液约2M1和等量的40NAOH相混合，再加入少量约1MG肌酸，充分振荡25MIN，在对照管中也加入相同的试剂，如培养液呈现红色，即
29、为VP阳性。有时需放置更长时间或在热水中稍加热，以加速反应进行。（8）过氧化氢酶试验将菌株接种于斜面，28下培养2D，取一洁净载玻片，在上面滴1滴10的H2O2，挑取1环培养了2D的菌苔进行涂片。若有气泡（即氧气）出现，则过氧化氢酶试验显阳性，若无则为阴性。另外，也可以直接将过氧化氢溶液加入斜面上，观察气泡的产生。（9）利用生化鉴定板对菌株进行精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、硫代硫酸钠、脲素等生化实验。124分子鉴定1241DNA的提取（1）取4支15MLEP管，各加入50L的超纯水；（2）用接种环从菌株的划线平板上挑取两环菌种于EP管中；（3）将上述EP管放入离心机中，转速10000RMP，离心1M
30、IN；（4）弃去上清液，加入150L的SPBUFFER含RNASEA，充分悬浮细菌沉淀；（5）加入20L的LYSOZYME溶液，混匀后置室温静置5MIN；（6）加入30L的EDTABUFFER，混匀后置室温静置5MIN；（7）加入200L的SOLUTIONA，剧烈振荡后置65保温10MIN；（8）加入400L的SOLUTIONB，剧烈振荡15S；（9）加入650L的SOLUTIONC，上下颠倒混匀，转速12000RMP离心1分钟；（10）弃去上层有机相后将水相溶液移入预先置于15ML离心管上的FILTERCUP中，转速12000RMP离心1分钟；（11）弃去FILTERCUP，在溶液中加入45
31、0L的DBBUFFER，混匀；（12）将试剂盒中的SPINCOLUMM置于COLLECTIONTUBE上；（13）将上述步骤11的混合液移至SPINCOLUMM中，转速12000RMP离心1分钟，然后弃去滤液；（14）将500L的RINSEA加入SPINCOLUMM中，转速12000RMP离心1分钟，然后弃滤液；7（15）将700L的RINSEB加入SPINCOLUMM中，转速12000RMP离心1分钟，然后弃滤液；（16）重复步骤15；（17）将SPINCOLUMM置于新的15ML的离心管上，在SPINCOLUMM膜的中央加入60L的无菌水，室温静置1MIN；（18）转速12000RMP离心
32、1分钟洗脱DNA。1242琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）制备1琼脂糖凝胶。称取015G琼脂糖置于锥形瓶中，加入15ML1TAE，于微波炉中加热煮沸至琼脂糖全部融化，取出后摇匀冷却到60左右。（2）选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离10MM。（3）在冷却至60左右的琼脂糖凝胶中，加入一滴溴化乙锭，摇匀，缓倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在35MM左右。在室温放置1小时待琼脂糖凝胶凝固后，小心地拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。（4）将电泳胶模放入电泳槽，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液的液面高出琼脂糖凝胶表面12MM左右。如果点样
33、孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。（5）将5LDNA样品与1L溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合，上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间以及判断电泳的位置。（6）用微量移液器将样品加入加样孔内，同时在一个孔内加入MARKER。（7）盖上电泳槽，开启电源，最高电压不超过5V/CM（100150V恒压电泳），使DNA移动方向为负极到正极。（8）1小时后，电泳完毕，关闭电源，戴一次性手套取出凝胶，尽可能将所有电泳缓冲液淋干，在254NM波长的透射紫外灯下观察。1243PCR扩增采用16SRRNA通用引物16SF和16SR进行PCR扩增。引
34、物16SF53AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物16SR53CCGTCAATTCCTTTRAGTTT；50UL标准反应体系（见表1），反应条件94预变性4MIN后，循环扩增34次94变性45S，55复性40S，72反应1MIN，循环结束后72延伸反应10MIN。表1PCR反应体系TAB1REACTIONSYSTEMOFPCR反应物体积（L）10PCR反应缓冲液（MG2）50DNTP混合物40引物16SF10引物16SR10RTAQDNA聚合酶05DDH2O381244从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段（1）用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳
35、；8（2）在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用吸水纸吸尽凝胶表面的液体（尽量切除不含目的DNA的凝胶以减小凝胶体积，提高DNA的回收率，切胶时不要将DNA长时间的暴露在紫外灯下，以防止DNA受损伤）；（3）切碎胶块，称量胶块重量并计算胶块体积（1MG1L）；（4）向胶块中加入胶块融化液DRBUFFER，其加入量如表2所示表2凝胶加入量TAB2GELATUMCONCENTRATION凝胶浓度DRBUFFER使用量13个凝胶体积量1154个凝胶体积量1525个凝胶体积量（5）融化液均匀混合后75加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化；（6）向上述胶块融化液中加入DRBUFFER和
36、一半体积的DRBUFFER，混匀；（4）将试剂盒中的SPINCOLUMM安置于COLLECTIONTUBE上；（8）将上述步骤6的溶液移到SPINCOLUMM中，转速12000RPM离心1S，弃去滤液；（9）将500L的RNASEA加入SPINCOLUMM中，转速12000RPM离心30S，弃去滤液；（10）将700LRNASEB加入SPINCOLUMM中，转速12000RPM离心30S，弃去滤液；（11）重复步骤10；（12）将SPINCOLUMM安置于新的15ML的离心管上，在SPINCOLUMM膜的中央加入20L的无菌水，室温静置1分钟；（13）转速12000RPM离心1MIN，洗脱DN
37、A。1245DNA片段的克隆与表达（1）感受态细胞的制备CACL2法1）挑取一环冷冻保存的大肠杆菌TG1（ECOLITG1），划线接种于LB固体培养基，37培养16H；2）从LB培养基平板上挑取新活化的ECOLITG1单菌落，接种于3MLLB液体培养基中，37下摇瓶培养16H；3）取2ML菌液接种于LB液体培养基中（50ML/250ML三角瓶），37下摇瓶培养3小时，然后立即置冰浴30分钟；4）将培养液移入灭菌的50ML离心管中，冰上放置10分钟后于4下转速3000R/MIN离心10MIN；5）弃去上清，用预冷的01MOL/L的CACL2溶液20ML轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4下转速3
38、000R/MIN离心10MIN；6）弃去上清，加入2ML预冷含01MOL/L的CACL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟，即成感受态细胞悬液；7）在感受态细胞悬液中加500L甘油，混匀后分装到25个EP管中，每管100L，于70冷藏贮存；（2）质粒的连接取微量离心管并编号，在各管中配制下列DNA溶液PMD19TSIMPLE测序载体05L9回收的PCR片段2LSOLUTION125L均匀混合后置于PCR仪中，16下反应16H，PCR仪中程序DIR5PROG19ZP16（3）转化1）取100L感受态细胞悬液于15MLEP管中，加入PUC质粒DNA溶液并轻轻摇匀，冰上放置30分钟；2）42加热4
39、5S后在冰中放置1MIN；3）向管中加入890L的LB液体培养基，均匀混合后37摇瓶培养1H，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因AMPR；4）将上述菌液摇匀后取100L涂布于含AMP100G/ML的LB固体培养基平板上，37倒置培养1624H；5）观察平板，长出的菌落可能就是转化了的菌，观察平板上白色菌落并计数，可进一步提取质粒鉴定；（4）PCR检验和扩大培养在长有菌的LB固体培养基平板上用枪头挑取两个白色菌落，在盛有10L水的小的PCR管中摇匀作为PCR扩增的模板，然后把枪头打入盛有AMP的LB液体培养基的试管中，进行扩大培养用于测序。PCR步骤同前，PCR结束后再进行琼
40、脂糖凝胶电泳检测，方法同前。1246测序及绘制系统树（1）目的基因的测序将转化成功的大肠杆菌TG1细胞送出进行目的基因测序。（2）BLAST序列比对将获得的16SRRNA序列提交到GENBANK用BLAST软件（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）与已知序列进行对比。（3）绘制系统树用CLUSTALX18MSW软件对该菌的16SRRNA序列与找出的相似序列进行排列，绘制系统树并确定它们的系统发生学地位。2结果与讨论21形态特征该菌平板培养菌落呈黄色、圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，液体静置培养溶液呈悬浊液。光学显微镜观察得菌株为直杆菌形状，无芽孢生成，见图1、图2。图1菌株的形态特征图2
41、菌株的形态特征FIG1THEMORPHOLOGICALCHARACTERISTICSOFBACTERIAFIG2THEMORPHOLOGICALCHARACTERISTICSOFBACTERIA1022生长曲线与产酶曲线特征如图3所示，菌株生长呈现一般微生物生长特性为S型曲线16，06小时为菌株生长的延滞期，6小时后进入对数期，18小时开始进入稳定期，而24小时后菌株由于底物浓度降低和其它代谢产物积累等影响导致部分菌株死亡，进入衰亡期。该菌株产生的降解组胺的酶，由产酶曲线初步推断为菌株的初级代谢产物。图3菌株生长曲线和产酶曲线FIG3THEGROWTHCURVEANDENZYMEPRODUCT
42、IONCURVEOFBACTERIA23生理生化特征231生长条件实验2311温度菌株在30斜面培养时长势较其他温度好。而一般在2045范围内生长的微生物为嗜温微生物，所以此组胺降解菌为属于嗜温微生物，见图4。图430时菌株在斜面的长势FIG4THEBACTERIAGROWTHATTHETEMPRETUREOF302312氧气11如图5所示，菌株穿刺接种后培养2D，菌落从底部生长至培养基表面，在培养基表面形成大量菌苔。可见，此菌株为需氧型微生物。图5菌株穿刺接种培养实验结果FIG5THECULTIVATINGEXPERIMENTRESULTOFBACTERIAPUNCTUREVACCINATI
43、ON2313PH微生物只能在一定的PH范围内生长，因为PH过高或过低均会导致蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性，甚至变性失活，并且会引起细胞膜电荷变化，影响细胞对营养物质的吸收。由实验结果，该实验菌株为中性微生物（最适生长PH在5580之间），见图6。图6不同PH对菌株生长的影响FIG6EFFECTOFPHONBACTERIAGROWTH2314盐度微生物在等渗溶液中才能正常生长繁殖。在高渗透压溶液中会使细胞失水而生长受到抑制，在低渗透压溶液中会使细胞吸水膨胀亦会影响微生物生长繁殖。该实验菌株在NACL浓度35之间均能生长良好（见图7），具有典型海洋微生物特点。这是由
44、于此菌株是从鲭鱼肉中分离筛选得到，而鲭鱼为海产鱼类，所以此结果与预期结果一致。12图7NACL浓度对菌株生长的影响FIG7EFFECTOFNACLCONCENTRATIONONBACTERIAGROWTH232生化鉴定结果该菌株革兰氏染色反应呈阴性。不能分解明胶，亦不能水解淀粉，可利用葡萄糖产酸但产气，可利用柠檬酸盐，硝酸盐还原阳性，MR阴性，VP阴性，过氧化氢酶阳性，具体结果见表3。表3生理生化鉴定结果TAB3THERESULTOFBIOCHEMISTRYIDENTIFICATION生理生化特性实验菌株中度嗜盐古菌革兰氏染色明胶水解试验淀粉水解试验柠檬酸盐还原试验硝酸盐试验硫代硫酸钠甲基红M
45、R试验甲基乙酰甲醇VP试验葡萄糖的氧化发酵试验产酸不产气甘露糖肌醇山梨醇鼠李糖蔗糖密二糖13续表3TABLE3CONTINUED生理生化特性实验菌株中度嗜盐古菌阿拉伯糖邻硝基苯半乳糖苷苦杏仁苷精氨酸赖氨酸鸟氨酸色氨酸脲素过氧化氢酶试验符号阳性；阴性从形态鉴定结果和生理生化鉴定结果可以看出，实验菌株与中度嗜盐古菌属的相同。但由于不同属之间些生理生化会有相同，和同一属中不同种之间生理生化特征也会有不同，所以需要进一步采用分子鉴定来判断。24分子鉴定结果241DNA提取结果DNA经提取后进行PCR扩增，后用琼脂糖凝胶电泳检测，然后割胶回收，回收后用凝胶电泳检测，其电泳结果如图提取结果，电泳结果如图8
46、所示，条带大概处于918BP处，表明DNA回收结果较好。图8DNA提取结果FIG8THERESULTOFCOLLECTEDDNA918BP14242基因克隆检测结果将回收的基因片段导入已提取的质粒中，然后将质粒转入大肠杆菌TG1中，经培养后取大肠杆菌进行PCR扩增，观察凝胶电泳检测结果。图9显示，目的条带大概处于918BP处，表明克隆结果较好。图9基因克隆后凝胶电泳图FIG9THERESULTOFGELELECTROPHORESISAFTERGENECLONING243目的基因测序结果经测序后所得该菌的16SRRNA基因序列如下CCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAACCTTGCGGCC
47、GTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATTGCGTTAGCTGCGTCACTAAGTCCTCAAGGGACCCAACGACTAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTATTATGCCAGAAGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCTCCCTCTCACATACTCTAGCTCTACAGTTTCAGATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA
48、TAGAGCCACCTACGCTCCCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCAGCTAATGTCATCGTCCATGGGTATTAACCATGGAGTCTTCTTCACTGCTTAAAGTGCTTTACAACCAAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCGGGCCGTGTCTCAGTCCCGGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGA
49、CCAGCTACAGATCGTCGCCATGGTAGGCCTTTACCCCACCATCTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTAATAGCGAGAGCAGTAAACTGCCCCCCTTTCTCCCGTAGGTCGTATGCGGTATTAATACGAGTTTCCCCGTGCTATCCCCCACTACTAGGTAGATTCCTAAGTATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCAGCGAGAAGCAAGCTTCTCCTGTTACCGCTCGACTTGCATGTGTTAAGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCT244经BLAST序列比对绘制系统发生树将测得的序列和GENBANK中的已知序列进行比对，进行系统发生学分析1720，该菌的系统发生树见图10。由图10得出，T6菌株属于PSYCHROBACTERSP并与PSYCHROBACTERCIBARIUS亲缘关系最近。3500BP3000BP15T6PSYCHROBACTERSPPSYCHROBACTERCIBARIUSPSYCHROBACTERURATIVO
