1、毕业论文文献综述生物技术CDK5靶向的海洋天然产物HYMENIALDISINE及其衍生物摘要海洋天然产物具有化学结构新颖、生物活性多样、作用机制独特的特性，已成为发现重要先导药物的主要源泉和研制开发新药的基础。本文介绍了海洋天然产物中存在激酶抑制剂，其中HYMENIALDISINE作为一种激酶抑制剂阻碍CDK5的活性过度表达，具有潜力开发成老年痴呆症药物或其前体。因其分子中含有不稳定的溴原子取代基，不具备作为药物分子所要求的稳定结构，故对其结构进行改造有望获得高稳定性、高选择性、高抑制活性的衍生物，高选择性的激酶抑制剂作为药物开发的先导化合物，其毒副作用较低，有利于提高药物后期开发的成功率。关
2、键词海洋天然产物；CDK5；HYMENIALDISINE；衍生物；激酶抑制剂海洋是目前资源最丰富、保存最完整、最具有新药开发潜力的新领域。近年来海洋天然产物越来越引起科学家们的关注，海洋天然产物与陆生天然产物相比具有更加复杂多样、新颖奇特的结构以及多元化的生物活性和机制。在浩瀚的海洋中存在着大量超乎人们想象的化学结构新颖、生物活性多样、作用机制独特的次生代谢产物,将成为发现重要先导药物的主要源泉和研制开发新药的基础。1海洋天然产物的最大来源者海绵海绵品种繁多、分布广泛、次生代谢产物复杂多样,是已知海洋天然产物的最大来源。近年来统计资料表明从海绵中发现的天然产物约占已发现的海洋天然产物总数的38
3、左右,从海绵中已发现大量的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性物质1。海绵生物活性物质按照化学结构类型可分为多糖类、聚醚类、大环内脂类、萜类、生物碱类、多肽类、甾醇和不饱和脂肪酸等。如HYMENIALDISINE和DEBROMOHYMENIALDISIN是首次从小轴海绵AXINELLASP中分离得到的含吡咯七元环内酰胺的生物碱类化合物，是天然的CDK5的选择性抑制剂2。海绵中存在结构和数量如此丰富的有潜力开发成药物的生物活性物质,使得对海绵的化学成分的研究成为海洋天然产物研究的一个热点和重点领域。2细胞周期蛋白依赖性激酶CDKS细胞周期蛋白依赖性激酶CDKS是细胞周期调节的核心,与细
4、胞周期蛋白CYCLINS、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子CKIS等组成细胞周期调控网络系统。CDKS的单体呈非活性构象，首先与其相应的细胞周期蛋白（CYCLINS）结合成CYCLINS/CDKS。组成全酶后仍无活性,CDKS作为催化亚单位,其活性状态由CDKS分子中的THR、TYR残基的磷酸化和去磷酸化修饰决定,首先CDKS分子上游的CDK激活激酶CAK催化其分子上ATP结合点附近的一个保守的苏氨酸被磷酸化,后再由CAK激活激酶CAKAK催化使THR残基磷酸化和TYR残基去磷酸化,CDK即被激活,而活化的THR残基去磷酸化则使CDK失活3。目前已发现十多种CDKS，包括控制细胞周期进程的CDK
5、1,2,3,4,6，控制细胞转录的CDK7,8,9和调控神经元损伤的CDK5。都有一个催化核心,均属丝/苏氨酸蛋白激酶家族,此催化核心的磷酸化和去磷酸化决定了细胞周期的运行。21细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）功能异常导致神经系统功能障碍细胞周期蛋白依赖性激酶5CYCLINDEPENDENTKINASE5,CDK5是细胞周期素依赖的蛋白酶家族中一个特殊成员,既非细胞周期素依赖，也不调节细胞周期，它具有一个特殊的功能即调控神经元损伤。尽管CDK5与其它CDKS在分子结构上很相似，但其活化方式却明显不同于其CDKS家族成员。单体形态的CDK5在真核细胞体内各组织均有分布，但只有脑组织中的CDK
6、5呈现高度的激酶活性4。CDK5要与P35、P39等激活因子相结合而被激活，而这些激活因子只特异地分布在中枢神经系统（CENTRALNERVOUSSYSTEM,CNS）中5，因此CDK5只在神经元中被激活，在CNS中发挥着尤为重要的作用。CDK5功能异常可导致神经系统功能障碍。除了对正常调控神经功能外，CDK5活性失调或异常分布均对神经元有毒害作用。如CDK5缺失导致脑皮质层状细胞性组构缺陷；CDK5缺陷小鼠运动神经元出现染色质融解、细胞气球样变、核偏位伴随神经丝堆积，表明CDK5缺失神经元存在轴浆运输障碍，因此CDK5功能正常对运动神经元的生存至关重要；在果蝇中，CDK5活性升高或降低均可导
7、致轴突靶向错误和对腹部运动神经靶向识别错误；CDK5的表达下调导致老年性学习记忆减退6。而CDK5的过度表达会引发老年痴呆，阿尔茨海默病（ALZHEIMERSDISEASE,AD）的特征性病理改变是神经元内神经原纤维缠结NFTS和神经元外老年斑SPS的沉积所造成的7。NFTS是由过度磷酸化的细胞骨架蛋白如，神经细丝组成，SPS主要由A构成,NFTS包含双股螺旋纤维PHF和直丝SF。PHF是NFTS的主要组成纤维,由两股亚单位以螺旋方式相互盘曲而成。PHF以缠结片段或分散细丝方式被分离。SF和PHF共有AU抗原决定簇。AU蛋白是构成PHF唯一必须的成分,异常磷酸化的AU蛋白堆积是NFTS构成过程
8、中最早期细胞骨架改变之一8。不同蛋白激酶和磷酸化酶系统对AU蛋白的超磷酸化作用能引发AU蛋白的结构和构型改变,进而影响它与微管蛋白结合和微管聚集能力。在正常大脑,AU蛋白磷酸化和去磷酸化之间的平衡调节着细胞骨架稳定性,影响轴突形态。在病理情况下如神经退行性变时,这种失衡可导致成熟神经元损伤。在AD病人脑中发现最早改变的是AU蛋白磷酸化。AU蛋白一些潜在性磷酸化位点能被CDK5和GSK3磷酸化,故CDK5和GSK3是引起AD样AU蛋白异常过度化的重要激酶，并被建议为药物治疗AD的新靶点9。陈娟等10在细胞水平观察细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5过度表达对神经细丝磷酸化的影响。培养N2A细胞，分为2组
9、，一组为转染组，一组为未转染组。转染组用脂质体转染技术将CDK5基因转入N2A细胞株中，并建立稳定表达CDK5的N2A/CDK5细胞株，免疫沉淀法及酶活性测定检测CDK5活性，免疫荧光和免疫印迹技术检测它的表达和神经细丝的磷酸化状态。结果在N2A细胞株转染组中，CDK5表达增加，并使抗体SML31显色增强，SML32显色减弱，提示神经细丝被过度磷酸化。与此同时，CDK5活性较未转染组提高35倍。由此可得出细胞水平的CDK5过度表达会导致CDK5过度激活和神经细丝过度磷酸化，而过度磷酸化的神经细丝导致神经原纤维缠结从而引发阿尔茨海默病。因此，通过小分子化合物对激酶GSK3和CDK5的抑制切断疾病
10、生成和发展的生化途径，是目前开发治疗老年痴呆疾病药物的研究方向之一11。当CDK5过度激活而且分布部位发生改变时，CDK5激酶的大量激活参与AU的磷酸化，促进AU蛋白堆积从而参与了阿尔茨海默氏病ALZHEIMERSDISEASE,AD、帕金森氏病PARKINSONSDISEASE,PD、亨廷顿氏病HUNTINGTONSDISEASE,HD以及脊髓侧索硬化症AMYOTROPHICLATERALSCLEROSIS,ALS等众多神经退行性疾病的发生发展8。因此,研究针对CDK5过度激活的药物,可能是有望从根本上治疗神经退行性疾病的有效途径。3海洋天然产物中的激酶抑制剂为了更好的利用这些海绵资源,寻找
11、有药用前景的海洋天然产物,张浩等2对中国南海三亚海域采集到的小轴海绵AXINELLASP的化学成分进行了研究,对其天然产物进行了分离纯化和结构鉴定。海绵经溶剂萃取、分配、ODS柱层析等分离手段得到了两个生物碱纯化合物,采用理化性质和波谱技术相结合的方法进行化合物的结构鉴定,确定这两个化合物分别HYMENIALDISINE1和DEBROMOHYMENIALDISIN2见图1。它们都是首次从中国海洋生物中分离得到的含吡咯七元环内酰胺的生物碱类化合物,是MAPK途径抑制剂,具有较高生物活性。RBR,HYMENIALDISINE1RH,DEBROMOHYMENIALDISINE2图1HYMENIALD
12、ISINE和DEBROMOHYMENIALDISINE的结构式31HYMENIALDISINEHYMENIALDISINE对与早老痴呆疾病相关的激酶GSK3和CDK5有很强的抑制活性,对激酶CDK家族的其它成员CDK16/CYCLINS,以及许多其它激酶例如激酶ERK1、ERK2、CK1、MEK等也具有低纳摩尔浓度的抑制活性2,很有潜力开发成因激酶GSK3和CDK5的活性过度表达导致的老年痴呆症药物或其前体。32DEBROMOHYMENIALDISINEDEBROMOHYMENIALDISINE可以抑制G2DNA损伤检查点和检查点激酶1CHK1和2CHK2。不同于其他检查点抑制剂DBH不抑制A
13、TM或ATMRAD3关联蛋白,很有可能作为治疗骨关节炎的药物或其前体2。33HYMENIALDISINE衍生物对具有生物活性的天然产物进行结构改造是寻找高选择性和高活性的药物侯选物的便捷、有效的途径之一。根据文献报道12，比较HYMENIALDISINE和DEBROMOHYRNENIALDISINE对MEKL的抑制活性可知，含溴与不含溴原子对MEK1的抑制活性相差90倍；比较DIACETYLHYRNENIALDISINE（3）与DIACETYLDEBROMOHYRNENIALDISINE（4）（见图2）对GSK3的抑制活性可知，含溴的类似物抑制活性为不含溴的类似物的4倍，而对CDK5的抑制，含
14、溴的类似物比不含溴的类似物的活性高2倍。RBR,DIACETYLHYMENIALDISINE（3）RH,DIACETYLDEBROMOHYMENIALDISINE（4）图2DIACETYLHYMENIALDISINE和DIACETYLDEBROMOHYMENIALDISINE的结构式虽然从上述的构效关系数据可知，溴原子的存在可使HYRNENIALDISINE获得高抑制活性，但是HYMENIALDISINE分子中的溴原子取代基不稳定，不具备作为药物分子所要求的稳定结构，同时对激酶的抑制也缺乏选择性。因此，对HYMENIALDISINE进行结构修饰，用亲脂性的药效基团替代溴原子合成结构稳定的类似物
15、，也可通过调控取代基的结构获得高选择性，并保持HYRNENIALDISILLE己有的高抑制活性。何勤飞13通过制备吡咯A位为不同芳香基团取代的HYMENIALDISINE衍生物来获得结构稳定并具有高选择性和高抑制活性的药物侯选物。用亲脂性的药效基团苯基、苄基替代了溴原子，通过合成反应完成了2苯基取代及2苄基取代的HYMENIALDISINE双键异构化的衍生物见图3，该化合物结构稳定，具有较好的亲脂性。RPH,2苯基取代的HYMENIALDISINE衍生物RRN,2苄基取代的HYMENIALDISINE衍生物图32苯基取代及2苄基取代的HYMENIALDISINE衍生物的结构式5小结HYMENI
16、ALDISINE是首次从中国海洋生物中分离得到的含吡咯七元环内酰胺的生物碱类化合物,是MAPK途径抑制剂,具有较高生物活性。HYRNENIALDISINE分子中存在的溴原子使其获得高抑制活性，但是溴原子取代基不稳定，不具备作为药物分子所要求的稳定结构，同时对激酶的抑制也缺乏选择性。因此，对HYMENIALDISINE进行结构修饰，选择不同亲脂性的药效基团替代溴原子合成结构稳定并具有高选择性和高抑制活性的药物具有重要的意义。在CNS中CDK5过度激活会参与众多神经退行性疾病的发生发展过程，故以CDK5为靶标，以海样天然产物HYMENIALDISINE及其类似物作为先导化合物，拟综合采用分子对接和
17、QSAR等计算机辅助药物分子设计的方法，了解CDK5ATP结构口袋的特性，指导CDK5抑制剂的设计。参考文献1BLUNTJW,BRENTRC,MUNROMHG,ETALMARINENATURALPRODUCTSNATPRODREP,2004,211492张浩,靳艳,张卫南海海绵AXINELLASP中两个含吡咯七元环内酰胺生物碱的分离鉴定J中药材,2006,2912129913013田翠孟细胞周期蛋白依赖性激酶与肿瘤关系的研究进展J实用肿瘤杂志,2010,2544995004陈洁,王中峰细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5在中枢神经系统发育和神经退行性疾病中的作用J生理学报,2010,624295308
18、5LEWJ,HUANGQQ,QIZ,ETALABRAINSPECIFICACTIVATOROFCYCLINDEPENDENTKINASE5NATURE,1994,37164964234266李红丽,杨忠,孙榆等老年性学习记忆减退与大鼠脑发育过程中周期素依赖性蛋白激酶5的表达J中国临床康复,2005,9242472497曲忠森,李亮,钟士江等糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调解AU蛋白磷酸化J生物化学与生物物理进展,2007,3412130813138王英鹏,宋俊峰,饶志仁CDK5与神经退行性疾病J生理科学进展,2004,35146479CHURCHETIAUTHERAPEU
19、TICSTRATEGIESFORTHETREATMENTOFALZHEIMERSDISEASECURRTOPMEDCHEM,2006,657959510陈娟,冯友梅,汪义鹏等细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5过度表达神经细丝磷酸化的影晌J中国临床康复,2005,92920821011NOBLEW,OLMV,TAKATAK,ETALCDK5ISAKEYFACTORINAUAGGREGATIONANDTANGLEFORMATIONINVIVONEURON,2003,3855556512TASDEMIRD,MALLINR,GREENSTEINMALDISINEALKALOIDSFROMTHEPHILIPPINESPONGESTYLISSAMASSAAREPOTENTINHIBITORSOFMITOGERRACTIVATEDPROTEINKINASEKINASE1MEK1JMEDCHEM,2002,45252953213何勤飞海洋天然产物HYMENIALDISINE衍生物的合成D四川大学,2007
