1、雌性大鼠在早期生活中接触锰导致上调下丘脑肿瘤相关基因与锰诱发儿童性早熟的关系,14营养研 M14831 黄玲艳,锰的介绍引言研究原因与原理实验材料与方法实验结果与讨论结论,manganese,GnRH：促性腺激素释放激素Kp：神经激肽BE2：雌二醇SAL：生理盐水AVPV：前腹侧室周POA：视页前区MBH：内侧基底下丘脑区RHA：喙下丘脑区,锰的介绍,人体“可能必需微量元素”之一，在人体内总量约为10-20mg，主要聚集在肝、胰、肾、骨骼中。生理功能：酶的组成成分或激活剂；维持骨骼正常发育；促进糖和脂肪代谢及抗氧化功能。此外，锰与生殖功能有关，缺锰可使生殖功能紊乱，精子减少。体内对锰的需要量从
2、正常膳食中可得到满足，一般不会缺乏。锰过量可引起中毒，主要损害中枢神经系统和生殖内分泌功能紊乱。中国营养学会推荐承认锰的AI值为3.5mg，婴儿、儿童、青少年、孕妇、入目因资料不足尚未制定锰的AI。糙米、米糠、麦麸、核桃、河蚌、茶叶、查费中锰含量丰，坚果、花生、干豆类也是锰的良好来源；精制谷类、脂肪、鱼、禽、肉、奶中含量较低。,锰的介绍,冶金工业中用来制造特种钢；钢铁生产上用锰铁合金作为去硫剂和去氧剂。如果在钢中加入2.53.5%的锰，那么所制得的低锰钢简直脆得像玻璃一样，一敲就碎。然而，如果加入13%以上的锰，制成高锰钢，那么就变得既坚硬又富有韧性。高锰钢加热到淡橙色时，变得十分柔软，很易进
3、行各种加工。另外，它没有磁性，不会被磁铁所吸引。如今，人们大量用锰钢制造钢磨、滚珠轴承、推土机与掘土机的铲斗等经常受磨的构件，以及铁锰锰轨、桥梁等。,引言,青春期前接触稍高于普通水平的锰能诱导雌性大鼠分泌青春期相关的激素，从而导致早熟。这与作用下丘脑的Mn导致GnRH分泌有关。因为青春期早熟是一种严重的神经内分泌紊乱疾病，我们测定早期生活接触锰是否会早熟上调一组早先确定与青春期肿瘤生长或抑制有关的基因表达、是否会提早青春期早熟时间。雌性大鼠幼崽从出生后的12天开始接受10mg/kg氯化锰或等体积的盐水灌胃，直至22天或29天。到时，采集血液进行雌二醇测定，下丘脑组织干冰冷冻直至评估基因表达。随
4、着Mn接触量的增加，大鼠表现出视前区和延髓GnRH基因表达的早熟激素的增加，这表明早熟导致特定肿瘤相关基因、青春期相关基因的表达。,研究原因与原理,通常青春期到来年龄取决于一系列因素：下丘脑GnRH合成的增加和释放。普遍认为，GnRH神经元功能在青春期的启动与代谢信号、基因、环境影响有关。因此，任何能促进或抑制青春期前GnRH释放的内源或外源的物质都能影响GnRH的中央活化，并有可能改变青春期正常发育过程。研究表明，大鼠和猴子的下丘脑的一些神经产物，包括胰岛素样生长因子1、兴奋性氨基酸、神经激肽B都能激活青春期前下丘脑垂体轴成熟过程。近年来，我们还发现，环境中的Mn能诱导大鼠青春期前GnRH的
5、释放。此外，当青春期前动物暴露于低剂量Mn，使青春期时间提前，且雌性比雄性更加敏感。Mn对下丘脑的作用表明，如果一个人太早接触低剂量但高水平的这种重金属，则可能对青春期有害。,研究原因与原理,性早熟是一种严重的内分泌紊乱，因此，这引起了有关青少年（尤其是女性，她们的青春期出现时间更早）对接触环境中的Mn的关注。了解更多的关于Mn在青春期的作用机制是重要的，特别是年轻人对Mn更敏感（但他们的的口服剂量还不确定）。Mn在青少年的血脑屏障穿透率是成年人的4倍，并且Mn会集聚在下丘脑。一个关于青春期启动的概念是，某个特定基因一旦被激活，可能协调下丘脑神经内分泌使其到达青春期。近年来，与肿瘤生长或抑制有
6、关的特定基因，也就是我们称之为肿瘤相关基因（TAGs）与青春期启动有关。最重要的是已确定的KISS-1基因，它编码Kp家族的蛋白，这些蛋白最早被认定为肿瘤抑制基因，但也是青春期前期GnRH分泌的强效刺激剂。在灵长类动物和大鼠都发现，青春期过程中下丘脑的KISS-1基因表达增加，这对所有种类生物（尤其是人类）的发育都至关重要。虽然KISS-1基因对青春期启动是十分重要的的，但它对上游下丘脑表达调节的研究才开始。,研究原因与原理,即使很多其他的肿瘤相关基因在性成熟过程中的大部分特定功能还不清楚，但被证实能提高青春期下丘脑的表达。已有证据表明，这些基因以错综复杂的网络结构组织，一些被认为是上调水平基
7、因(包括KISS-1），且在它们之间存在互联性。因为Mn是环境中存在的物质，且可能刺激下丘脑青春期前期GnRH的释放，会引起性早熟发育。因此，确定影响青春期肿瘤相关基因的影响因素并确定它们之间的表达（包括KISS-1的表达）是十分重要的。我们已证实青春期前期接触Mn可上调一组与青春期相关肿瘤基因的表达。,实验材料与方法,动物：未成熟雌性大鼠。12h光照、12h黑暗交替，23。饮食:Harlin Teklad 2016 ，铁和锰由微量元素实验室确定以保持精确。所有程序遵守大学护理和实验室动物护理使用健康指导。实验过程：,为了验证锰在青春期过程中有联系、导致早熟的作用，它必须在青春期前期积聚在下丘
8、脑。因为锰缺乏或过量都可改变大脑功能，所以进入大脑的锰的量是重要的。,实验材料与方法,基因选择：GnRH、KISS-1、GPR54（神经激肽B受体）：测定接触稍高水平锰是否导致表达Cutl-1、YY1：与KiSS有最强交联性USF2（上游刺激因子2）：与生殖功能有关TSC1（结节性硬化症）、MAF（肌肉腱膜纤维肉瘤）、p53、cyclinD1（细胞周期蛋白）：细胞分化、生长、发育调节剂Rheb（大脑同族体）、mTOR（雷帕霉素哺乳动物靶细胞）：与KiSS的联系DMT1（二价金属转运蛋白）：与锰转输有关,实验材料与方法,提取总RNA：大脑匀浆中提取，测260nm的分光光度值。反转录和实时定量PC
9、R：总RNA（1ug）反转录为DNA（cDNA），ABI PRISM7500序列检测系统精确操作。激素分析：雌二醇如前述分析。锰测定：血清、大脑锰由电感耦合质谱仪测定。统计分析：T检验。INSTA和Prism软件，数据以平均值标准差标示，P值小于0.5被认为是差异显著。,实验材料与方法,数据的动物来源：22日龄的34只对照和34只锰接触动物；29日龄的41只对照和41只锰处理动物。血清雌二醇和锰含量、大脑POA/ RHA区和MBH区的E2和锰含量：22日龄的8只对照和8只锰处理大鼠，29日龄13只对照和13只锰处理大鼠。,22日龄、29日龄时雌鼠血清和大脑锰含量,在两个时间点，锰处理动物显示出
10、该元素在大脑AVPV/ POA区和MBH区的积累。在22日龄时，血清雌二醇含量是相似的；29日龄时，锰处理组的血清雌二醇水平有显著增加,接触低剂量锰的动物较对照组表现为青春期前下丘脑锰的积累。即使实验组较对照组血清锰水平也偏高，但不明显，这可被在22日龄、29日龄早上组织收集时间段没灌胃锰物质、持续排泄24小时解释。,锰对GnRH基因表达的影响,在22日龄时，锰没有影响大脑POA/RHA区GnRH基因的表达；但是在29天日龄时，锰引起GnRH基因的表达，且该动作与血清E2水平提高相关联。,MBH区不存在GnRH神经元，所以该区没有测定。,锰对KISS和GPR54基因表达的影响,在29日龄时，锰
11、接触组较生理盐水组在POA/RHA区KISS-1、GPR54表达增加；在22日龄时，锰接触组较生理盐水组只有GPR54表达增加。,在MBH区，在任何时间，与生理盐水组对照，锰没有影响KISS-1或GPR54表达。,KiSS基因表达在POA/RHA区表达提高而在其它区没影响，可被基因对雌二醇的区域相应差异来解释。,多项研究表明，雌二醇差异调节啮齿动物AVPV区和ARC区Kp的表达。Mayer等人认为，条件敲除Kp神经元的雌激素受体基因，揭示了这些神经元在AVPV区是由青春期早期雌二醇循环反馈的，继而导致GnRH合成，但同时ARC区的Kp神经元是由ER信号抑制的。我们的研究符合前人研究的关于接触锰
12、引起早熟、雌二醇水平提高，导致KiSS基因差异区域相应。差异表达可在POA/RHA区而非MBH区GPR54在22日龄时表达可见，而POA/RHA区KiSS-1基因的上调要在29日龄时才可见。即使GPR基因在22日龄时对锰由响应，而此转录调控尚不清楚，它不是对雌二醇响应的，因为在22日龄时它的表达依旧很低。锰诱导响应使重要的，因为Kp受体是在大脑区域的GnRH神经元上的。如前所述，29日龄时POA/RHA区KiSS的表达是在雌二醇的强烈影响下，导致29日龄时锰处理动物教对照组早熟明显。因此，低剂量接触锰导致GPR54基因的表达，导致KiSS基因表达，导致青春期前期GnRH的分泌。鉴于KiSS-1
13、的激活是青春期必不可少的，我们开始选择一组转录因子肿瘤相关因子（与KiSS基因控制有关、被锰影响），识别青春期表达的增加。,锰对USF2、Cutl-1、YY1基因表达的影响,锰没有影响29日龄或22日龄时，POA/RHA区的USF2、Cutl-1、YY1基因的表达。,Rheb是肿瘤相关因子，作为营养型号输出至mTOR的中间体，而mTOR是通过Kiss调控的青春期和生殖调控的调控者。因此，我们的结果证明锰可导致Rheb（mTOR的上游调节器）的表达。证明锰是否作为营养信号或其它生物化学机制激活Rheb还需更多研究。一旦Rheb被激活，Rheb直接结合mTOR，这个交互对mTOR的活化是必需的。它
14、是营养响应细胞生长调控的中介，并参与青春期中心活化。要注意的是29日龄POA/RHA区（而非MBH区）Rheb和mTOR表达的增加是与KiSS表达增加相联系的。MBH去Rheb和mTOR增加也许说明它们是该区的另一种角色，如营养信号。,锰对Rheb、mTOR基因表达的影响,29日龄时，锰提高这两种基因的表达。,和29日龄时其他基因反应相同，可能是长期接触锰导致锰在大脑的积累、青春期前期提高的雌二醇水平综合作用。一项先前研究表明，mTOR基因的阻塞导致KiSS-1和GnRH基因表达的降低。这两项研究表明，此途径的激活或抑制，会导致KiSS-1和GnRH基因表达向反方向。此外，他们作为KiSS-1
15、或Kp在调节GnRH基因的一个指示剂，GnRH神经元表达Kp受体GPR54。因此，我们目前结果清楚地表明此途径被锰的激活提高青春期前期GnRH神经元功能和早熟发育有关。,锰对TSC1、Cyeclin D1、p53基因表达的影响,锰没有影响POA/RHA区TSC1的表达。相反地，图B和C表明：29日龄时，锰提高细胞周期蛋白D1和p53的表达。而在22日龄时，锰没有改变POA/ RHA区基因的表达。,TSC1表现负调节Rheb和mTOR途径。早熟导致29日龄时POA/RHA区cyclin D1和p53基因的表达，在22日龄和29日龄时该脑区Maf被诱导表达。在MBH区只有cyclin D1被锰诱导
16、表达较正常青春期提高。即使锰激活p53，但它没有影响YY1（p53的一个重要的负反馈调节器）。因为cyclin D1、p53、Maf都具有关于细胞分化、增殖的功能，并与正常青春期启动的基因表达提高有关。因为锰导致早熟也提高了他们各自基因的表达，这些基因可能在青春期发育中扮演重要的角色。,锰对Maf基因表达的影响,在22日龄和29日龄时POA/RHA区Maf在都显出表达的提高。,在MBH区，只有29日龄时，D1基因表达提升；而22日龄时，没有观察到这些基因的表达改变。,锰对DMT1基因表达的影响,锰没有在22日龄时改变POA/RHA区DMT1基因表达，但它引起了29天的基因表达。,在MBH区，2
17、2日龄和29日龄时都没影响DMT1基因表达。,DMT1是一个能转运金属（包括锰）通过细胞膜的肿瘤相关因子蛋白。在大脑，DMT1定位在BBB神经元、毛细管上皮细胞、脑脊髓液脉络膜丛上皮细胞。锰进入大脑，要么通过血管或脑脊髓液。POA/RHA区和MBH区是与第三脑室紧密联系的。锰迅速聚集在脉络膜丛，影响大脑成熟、体内平衡、神经内分泌功能。随着血锰水平提高，锰进入脑脊髓液、脉络膜丛也增加。我们首次证明锰在29日龄时在POA/RHA区导致DMT1基因表达的。不管锰是否是青春期DMT1的一个重要角色，或像其它肿瘤相关基因（例如KiSS基因表达）一样影响青春期特定过程，有待考证。,结论,我们的结果受体证明
18、锰是一种外因的在性成熟中扮演促进生理信号表达的角色，至少，通过下列途径导致GnRH分泌：因为这种功能和其他可能功能的影响，早期接触低剂量的锰对性早熟有促进作用。这已被很多事实证明：锰在青少年更容易穿过BBB，而没有能力去消除。青春期前女性在POA/RHA区、MBH区累积锰。此外，婴儿和小孩被认为对超量的锰敏感，很大程度上是因为锰的最佳摄入量还没有被确定。在锰新陈代谢中还观察到性别差异，如雄鼠清楚锰的能力是雌鼠的2倍。,结论,目前证据表明青春期启动年龄在变早，性早熟在增加，特别是在女孩中。即使原因还未被确定，青春期启动时间也许是环境和基因影响的一种可能性交互联系。早熟是因GnRH释放系统的激活而
19、释放GnRH造成的依赖性结果。有趣的是，在男孩下丘脑，下丘脑错构瘤往往是青春期启动的因子，其它中枢神经系统病变、家族疾病占了一部分，而先天因素只占了10%。在女性中，超过95%早熟没有特定成因，而且青春期要么正常要么出现太早。及时锰在两性中都可引起青春期提前出现，但男性的剂量是女性的2.5倍。因此，女性对锰更敏感。因为环境中的锰可能对青春期启动有作用，以防万一早期接触而导致了早熟，所以确定这个敏感性是重要的。,结论,我们证明了接触低剂量锰激活特定上有基因调节青春期前下丘脑GnRH水平。这些动作，至少在我们所研究的动物里，是由锰导致的性早熟。因此，关注锰的早期生活暴露关乎儿童的健康。,欢迎指导！,
