1、毕业论文文献综述水产养殖福尔马林固定动物组织的DNA提取方法的探讨摘要本文主要介绍福尔马林固定动物组织的DNA提取的方法的探讨。关键词福尔马林固定；DNA提取分子系统学的研究首先必须获取足够含有遗传信息的生物样品，既包含有核酸、蛋白质的样本。但在实际工作中有时要获得足够样品非常困难，如对于种群小、濒危、分布区窄的动物来说，采集标本的成功率较低。如何从馆藏标本中获取需要分析的遗传样品，成为了分子系统学研究探索的途径。首先，馆藏标本由于多年的积累，收藏标本齐全，花费较小的人力、物力就可获得分子系统学研究样品；其次，减少了对现有动物的干扰，对于珍稀动物这点尤为重要；第三，通过馆藏标本的研究，排除了由
2、于遗传物质转移、物种迁移等形成的系统分析的混乱。并且从标本的类型来说，模式标本、地模标本等在系统学研究中的作用有很大差别，前者更具有说服力。所以，如能从馆藏标本中直接获得实验样品，将极大的有利于动物系统学的研究。核酸的分离与纯化是分子生物学研究中重要的技术，现有的DNA提取与纯化方法一般只适用于新鲜材料，虽然对于一些较为特殊材料的DNA提取已提出一些专一方法，但是对于福尔马林长期保存生物标本基因组DNA的提取至今未能彻底解决。作为生物标本的保存液，福尔马林的优点在于渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快,具有能快速杀死生物细胞以固定生物大分子的功能。因此在过去的若干年中,世界各国生物学家采集了大
3、量生物标本并保存于福尔马林中,这些标本在研究物种起源、系统进化、特定物种基因资源保护以及生物多样性等方面具有很高的学术研究价值。如不能正常提取基因组总DNA,就会给从分子水平上比较研究这类生物带来障碍。1历史实验方法整理11方法一111标本的预处理取浸泡于福尔马林中大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量，用PBS溶液冲洗，放在灭菌的吸水纸上将其揩干，于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成50MG的小块，放入PBS液浸泡1224H后转入70的乙醇中处理1224H。依次换入下列梯度酒精中处理80乙醇，2H，重复一次；90乙醇，2H，重复一次；95乙醇，2H，重复一次；100乙醇，1H，重复一次。然后将材料放入1
4、/2倍的PBS液中浸泡12H，其间更换一次溶液。112基因组DNA的提取与纯化提取方法参考SAMBROOCK等人1989，部分步骤加以改进。加蛋白酶K的量按标准量100G/ML，在5056温度36H处理过程中，不断轻摇混匀，视消化效果可以重复加入标准量的1/2倍蛋白酶K进行消化，直至将材料完全消化为止；酚氯仿抽提最后一次的上清液移入透析袋中透析；沉淀DNA时，在20下20MIN效果为宜1。12方法二121固定标本的处理1取约20G浸泡于福尔马林溶液中的大仓鼠肝脏标本，置于广口称量瓶中，用70乙醇冲洗2次。（2）使用灭菌牙签将组织分成03CM左右的小块，分装于几只15ML灭菌离心管中。3接下来依
5、以下程序进行处理PBS磷酸盐缓冲液缓冲液处理24H70乙醇处理12H无水乙醇处理12H1/2PBS处理24H灭菌水清洗1次GTE甘氨酸缓冲液处理24H1/2PBS处理24H灭菌水清洗1次最后用蒸馏水清洗至少3次，弃去处理液并用滤纸吸水备用。2122基因组DNA的提取1将已经预处理的标本组织分别置于15ML离心管中，在每只离心管中先加入600ULDNA抽提缓冲液，机械碎裂组织块直至粉末状，颠倒混匀后放于37水浴锅里水浴1H。2取出离心管，每只各加1520UL蛋白酶K浓度为L0UG/UL，然后55水浴，消化3H甚至过夜，其间应不时混匀。3加入等体积TRIS饱合酚，温和摇动10MIN；10000RP
6、M，4离心10MIN，将上清液转移至另一只干净离心管中，加入等体积TRIS饱合酚再抽提12次。4然后加入等体积酚氯仿11抽提和氯仿抽提各1次。5上清液用无水乙醇20沉淀DNA约30MIN。670乙醇漂洗2次。无水乙醇沉淀5MIN，4稍离心。7室温干燥后用适量无菌水溶解DNA。13方法三131DNA提取用消毒的剪刀取福尔马林固定标本大腿肌肉，切成01CM，用70的酒精清洗48H，中间间隔2H左右换一次溶液。酒精清洗完毕后，用去离子水洗涤3次，在60温度的烘箱中彻底烘干。取已灭菌EPPENDORF管加入600L的消化液,消化液的配方为STE500L；10SDS60L蛋白酶K001G/ML30L；D
7、TT1MOL/L24L。将上述烘干材料，放进坩埚加入一定的液氮磨碎成细粉，移入消化液，55消化30H。在消化的过程中每间隔3H将样品缓慢颠倒一次。消化结束后，4500R/MIN离心，取上清液。加入600L苯酚/氯仿/异戊醇25241，旋转架旋转5MIN，使样品混合均匀。9000R/MIN离心10MIN，取上清液。重复上述步骤一次。加入600L氯仿/异戊醇241，旋转架上旋转5MIN，使样品混合均匀。9000R/MIN离心10MIN，取上清液。在上清液中加入60L的NAAC和1000L的预冷的无水酒精，20低温沉淀1H，12500R/MIN离心15MIN。70的酒精洗涤，12500R/MIN离心
8、3MIN。重复一次。室温自然干燥后，溶解于30L的TE液中。对照酒精标本按常规DNA方法提取。312对DNA提取的改进为了提高提取的标本DNA的质量，很多研究者对提取过程进行了改进，实验的成功率各不相同GOELZ等6提取的DNA中有75可用于遗传分析，DUBEAU等7提取的DNA中有50可用于遗传分析，而COOMBS等8提取的全部DNA都可用于遗传分析。POLJAK等9认为DNA提取和扩增的效率似乎与DNA提取过程的简化程度成反比，即提取过程越简化，提取和扩增效率越低。10对DNA提取过程的改进措施主要包括对材料准备、预处理和提取3个阶段的改进。材料准备选肌肉和骨组织可以提高DNA的产量9。预
9、处理加入缓冲液可以降低DNA破坏程度11,12。中性缓冲液可以降低DNA交联的产生13。样品经过真空干燥可以降低标本中福尔马林含量14。逐步干燥和临界点干燥可以降低标本中福尔马林含量15。提取蛋白酶K过量16、添加还原剂DTT17、在预消化缓冲液1中加入氨基乙酸可以提高DNA的产量。添加SDS可以是细胞充分混匀和溶解18。延长消化时间可以提高蛋白酶K的消化效率7。2对提取的DNA进行PCR扩增由于利用标本DNA进行PCR扩增的效率比利用新鲜材料进行扩增低,因此必须对PCR扩增过程进行优化。主要的改进措施包括缩短提取DNA的保存时间即提取之后马上进行扩增、调整DNA模板浓度、增加扩增反应循环次数
10、和每一步的反应温度、提高退火温度、进行二次扩增。3提取的DNA进行监测分别用紫外分光光度计和08琼脂糖凝胶电泳监测。4讨论ARRIGHI19说“从福尔马林固定的标本中提取DNA比从任何其他种固定剂固定的标本中提取DNA都难。”从以上各种方法进行比较，从福尔马林固定动物组织中提取DNA的过程比从新鲜组织中提取的过程较为复杂，并且所得DNA的质量有所下降。其原因可能是福尔马林中的化学成分对DNA的结构有一定程度的破坏，动物组织中的福尔马林对提取物有一定的抑制作用。所以此类实验重点在于降低福尔马林对提取物的抑制。不过，方法的选择还要在实验的过程中体会和总结。5参考文献1徐来祥,张知彬,宋铭晶,等福尔
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