1、毕业论文文献综述生物工程环境废物净化芽孢杆菌的筛选及其代谢特性初步研究摘要通过对芽孢杆菌的菌体特征、分类、芽孢特性进行简单介绍，介绍并比较现有的芽孢杆菌分离纯化及鉴定方法，对芽孢杆菌产酶特性与芽孢杆菌在养殖业及杀虫方面的应用做了简单介绍。关键词芽孢杆菌分离鉴定代谢特性应用芽孢杆菌是一大群需氧或兼性厌氧、G目前发现有G一的并在一定条件下可形成芽孢的化能异常杆菌1。1芽孢杆菌的分类90年代以来，芽孢杆菌的分类已由原来的2个属发展到目前的13个属，130多个种。13个属分别为芽孢杆菌属（72种）、芽孢乳杆菌属（5种）、兼性芽孢杆菌属（1种）、硫化芽孢杆菌属（3种）、耐热芽孢杆菌属（1种）、脂不酸芽孢
2、杆菌属（4种）、类芽孢杆菌属（27种）、喜盐芽孢杆菌属（3种）、短芽孢杆菌属（10种）、解硫胺素芽孢杆菌属（3种）、枝芽孢杆菌属（2种）、需盐芽孢杆菌属（1种）、薄壁芽孢杆菌属（2种）。其中后八个属是1992年到1999年间从芽孢杆菌属中独立出来的新属2。2芽孢杆菌的芽孢芽孢是某些细菌在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。它们对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在7080时10分钟就死亡，而芽孢在120140还能生存几小时，营养细胞在5苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极
3、低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。21芽孢形态结构不同细菌中，芽孢所处的位置不同有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形或椭圆形。而且时常在芽孢附近产生伴孢晶体3。22芽孢形成一般认为，芽孢是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而是适应不良环境的产物。但实际上，可能不完全如此。决定芽孢形成的根本原因在于细菌内部，细菌染色体上有控制芽孢形成的基因。细菌在营养生长中，这些基因通常不表达，它们可能被一个阻遏体系所控制，一旦这一阻遏消除，就可导致芽孢形成。芽孢形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面变化。光学显微镜和电子显微镜观察研究结果，表明芽孢的形成在结构上主要经
4、历以下几个阶段核物质融合成轴丝状（杆状）。在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体。在光学显微镜下观察未染色的活细菌，可以看到前孢子是一个清亮的、与菌体其他部分明显不同的区域。前孢子再被多层膜包围，如皮层、孢子衣等，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁的溃溶而释放出来。23芽孢作用或应用231分类鉴定不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，因此可以作为分类鉴定的依据或参考。232科研材料由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。
5、233保存菌种芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。234分离菌种芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离。将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。235生物杀虫有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。3芽孢杆菌的分离纯化方法芽孢杆菌有很多分离纯化方法，各有优劣。31芽孢杆菌的分离方法一般方法为配制完整营养成分比例恰当的分离平板培养基，通过采用梯度稀释涂布平板法进行菌种的分离。4普通方法为配制有一定
6、限定因素的完整营养成分分离平板培养基，仍旧是梯度稀释涂布平板法分离。如产乳酸芽胞杆菌，则配制酸性培养基PH为55，这种PH条件下，可抑制许多其他杂菌生长，然后再梯度稀释涂布平板法分离得到数量更少的菌落5。除了一般分离方法、普通分离方法外，还可根据其独有特征芽孢而进行分离。上面已经提到，芽孢可耐高温而仍旧存活，普通菌体则不然，据此提出了高温处理菌液而分离出芽胞再促芽孢萌发形成芽孢杆菌的方案。这种方法可先对样品进行分离，方法同上，挑选到单个菌落再在生理盐水中水浴加热一定时间6。也可先对样品进行加热再去分离单菌落，从而再对单菌落有目的有针对性的去鉴定菌种7。两者相比较，在我看来，结果应差不多。但前者
7、难以避免地就要重复多次，有很大的盲目性，可能在分离单菌落时因浓度梯度选择不合适而没有挑出而导致最后结果不如人意，后者则是通过高温而对其内所有菌种进行杀灭仅留其芽孢，再提供适宜的环境使残留下来的芽孢萌发而得到纯种，相对来说优于前者。比较上述一般分离方法、普通分离方法、特殊分离方法这三种分离方法后，很明显的可以看出特殊分离方法，即优先加热杀灭普通菌体，促其芽孢在特定培养条件萌发为菌体更为可靠及简捷，同时也是专门适用于芽孢杆菌分离的方法，有很大的优势。此方法在筛选芽孢杆菌时被很多人采用89。除了以上的盲目的筛选，还可以在特殊分离方法基础上，采用唯一碳源为纤维素的专一培养基进行联合筛选。此种定向分离方
8、法可以为后面纤维素水解试验作成功的保证10。32芽孢杆菌的纯化方法芽孢杆菌的纯化方法与其他菌没有什么太大的不同，如果不纯则可继续用梯度稀释涂布平板法分离再划线纯化或直接进行划线纯化，如连续划线、分区划线11。4芽孢杆菌的鉴定41鉴定方法的比较上面已提到，最近发现至少130种芽孢杆菌，它们彼此之间既有着某些共同的性质，如均可在一定条件下产生芽孢，大多数都为革兰氏阳性菌；但同时却也有着不小的差异，如各个生理生化特性都不尽相同。如果进行菌种鉴定的话，最可靠的还是尽量能做16SRDNA序列分析，比较同源性而鉴定具体为哪种芽孢杆菌，从而可针对性地查出其他的所有特征，如菌落形态、菌种显微形态、生理生化结果
9、等。但考虑到经费消耗不菲，时间耗费太久，并且最根本的是在本实验中对具体菌体要求没有严格到鉴定出具体种属，仅仅需要确定所筛选菌种为芽孢杆菌以满足课题基本要求即可，所以16SRDNA序列分析不是必须的。在实验室条件下，可以很简单的完成菌落形态的肉眼观察、单个菌的显微观察、以及利用实验室药品配置生理生化培养基进行生理生化实验，通过这些指标已经基本可以确定是否为芽孢杆菌。方法主要参照伯杰细菌鉴定手册第八版12、微生物学实验手册13、微生物学实验技术教程14及微生物学实验15，并按其基本方法进行。42菌种鉴定指标经过多个文献的查看及检察必要性，发现对芽孢杆菌的鉴定主要在以下几个方面。菌落形态包括其形状、
10、表面特征、边缘、光学特征、颜色等方面16。个体形态采用革兰氏染色，然后在光学显微镜下观察细菌的形状；用芽孢染色法在光镜下观察芽孢的形状17生理生化鉴定15进行糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）试验、吲哚试验、甲基红试验、VP试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、酪素水解试验等一系列试验，对其进行鉴定。序列鉴定如果条件允许的话，可做16SRDNA序列分析，比较同源性而鉴定是否为芽孢杆菌18。5芽孢杆菌的产酶研究已分离到的纯种芽孢杆菌的代谢特性，因为生物体的代谢过程就是吸收有机物释放代谢废物过程，其实就是对其一些产酶特性做一些研究，也就是说对生物体摄取的有机物的一些成分的分解及对代谢废物一些成分的分解的研究
11、。芽孢杆菌可产生蛋白酶1920，纤维素酶21、淀粉酶20、脂肪酶22、过氧化氢酶19等等。同时其有不错的除臭功能23，故有些菌很可能没有水解色氨酸产生吲哚的能力，也就是缺乏色氨酸酶，此可考虑为以后重点关注的指标。6芽孢杆菌的应用芽孢杆菌广泛分布于空气、土壤、水及动物肠道中，在各个空间各个领域发挥着自己的作用。61芽孢杆菌在养殖业中的应用芽孢杆菌可制成适宜菌剂掺入饲料作为饲料添加剂喂养家禽24家畜25。芽孢杆菌在养殖业中，可提高畜禽生产性能，防治畜禽疾病26，净化养殖环境。它们可调节消化道微生态平衡，提高畜禽消化能力，提高畜禽免疫力，产生营养素27。蜡样芽孢杆菌微生态制剂已在养殖业上得到应用28
12、。蜡样芽孢杆菌以孢子状态进入动物消化道后,生长繁殖、支持厌氧菌的生长繁殖,保持肠内微生物与动物之间处于微生态平衡状态,同时参与肠道内的物质代谢,从而达到抗菌、促进生长、提高饲料利用率的作用29。动物的正常新陈代谢过程中，淀粉、脂肪、蛋白质等在体内不能完全的利用，而或多或少有一部分随着粪便进入肠道，不免造成资源的浪费，而且这些有机物在体外的环境下很容易腐败变质，发臭造成环境的污染与破坏。芽孢杆菌如果能对其进行利用，则即能节约资源又可保护净化环境。不少动物体内都缺乏纤维素酶，所以食入体内的植物中的丰富的纤维素都随着粪便排出，纤维素是植物材料的主要成分，是地球极为丰富的可再生资源。纤维素的结构复杂，
13、自然界中在纤维素酶的作用下纤维素可彻底水解成葡萄糖。充分利用这些纤维素又是课题的一个基本内容30。且芽孢杆菌产生的过氧化氢酶可以分解肠道内的过氧化氢生成游离氧，对肠道内的多种病原菌有杀灭作用，如果芽孢杆菌不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，可有效降低血液及粪便中吲哚的浓度，起到净化环境的作用31。而幼仔动物肠道中消化酶的分泌不足消化能力差，而且肠道内的大肠杆菌等腐败菌增多，会产生一些有害物质如吲哚、氨和硫化氢等，这些物质能潜在抑制生长和致癌作用。需氧的芽孢杆菌在肠道中主要通过生物夺氧维持肠道生态平衡，它在肠道中短时间定植后，可以消耗大量氧气，维持肠道的厌氧环境，为消化道中的乳杆菌、肠球菌和乳球菌
14、等兼性厌氧菌及拟杆菌等厌氧菌提供更为理想的生长环境，增强肠道对厌氧菌的定植能力3233。参考文献1CLAUSD,BERLDEYRCWBERGEYSMANNUALOFSYSTERMATICSBACTERIOLOGYM1986110511402韩延平,杨瑞馥需氧芽孢杆菌分类学研究进展J微生物免疫学进展,2001,29473783黄素芳,朱育菁,刘波,等苏云金芽孢杆菌LSZ9408伴孢晶体的形态特征研究J武夷科学,2006,22137404马丹丹分解纤维素霉菌的分离，纯化与鉴定J价值工程,2010,42161441455陈晓春产乳酸芽孢杆菌分离以及生物学特性研究J中国牧业通讯,2006,123676
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