1、,淋巴细胞表面抗原检测 -免疫荧光法2014-11-13 硕士班,2,基本概念,所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。,包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞、干细胞。,3,免疫细胞分离方法：根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS根据细胞理化性质： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细 胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感,淋巴细胞是指在适应性免疫中起关键作用的白细胞，由淋巴器官产生，机体免疫应答功能的重要细胞成分。主要指B淋巴细胞和T淋巴细胞，二者表面抗原
2、受体具有高度多样性，经抗原激发可分化为抗原特异性效应细胞，分别介导体液免疫和细胞免疫。淋巴器官根据其发生和功能的差异可分为：中枢淋巴器官（又名初级淋巴器官）：包括胸腺、腔上囊或其相当器官。它们无须抗原刺激即可不断增殖淋巴细胞，成熟后将其转送至周围淋巴器官。周围淋巴器官（又名次级淋巴器官）：包括脾、淋巴结等。 成熟淋巴细胞需依赖抗原刺激而分化增殖，继而发挥其免疫功能。 在此我们将要讨论CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的方法和意义。,2018/7/28,淋巴细胞,5,T淋巴细胞是机体免疫系统中的主要调节及效应细胞，在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用，可通过对抗原识别、处理、递呈引起多种细胞因子同多
3、种细胞之间的网络联系，构成维持免疫功能的生理平衡，维持着机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。,T淋巴细胞,2018/7/28,早期将T细胞中的CD4+T细胞分为Thl和Th2两个亚群。 Thl细胞通过分泌IL-2、IL-12、IFN-和TNF-等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。在抗感染、抗肿瘤反应中发挥重要作用。 Th2细胞则通过分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增
4、殖并产生抗体，促进机体的体液免疫应答。,2018/7/28,调节T细胞(Treg细胞)也是近年来认识的一种重要的免疫调节细胞， CD4+ T细胞在TGF-单独的诱导下则而分化成Treg细胞，分泌TGF-并表达Foxp3，参与免疫的调节。 Thl7是一种能产生IL-17却不产生IFN-和IL-4的CD4+T细胞，目前的研究证实了TGF-和IL-6在Thl7细胞分化启动过程中的重要作用。同时，转录因子STAT3和RORt，在Thl7的分化过程中也起着重要的调节作用。,2018/7/28,Th1/Th2亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2平衡的失调与多种疾病的发生发
5、展和预后有着密切的关系。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2平衡有关。建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法： 酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。,2018/7/28,分化抗原 cIuster of differentiation, CD不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中,出现或消失的细胞表面标志。细胞表面标志通常用单克隆抗体来识别。每个抗体都有指定的CD编号,能被特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号,例如,被“CD1抗体”识别的抗原称为“CD1抗原”。,
6、CD4细胞，作为淋巴细胞的一种，是人体中调控免疫系统最重要的枢纽细胞，其数量能够最直接的反应人体免疫功能的状态。CD4细胞检测广泛应用于对人体免疫功能状况的评估，有助于肿瘤、糖尿病、冠心病、艾滋病等疾病的早期发现及临床诊疗,2018/7/28,人体内的淋巴细胞在光学显微镜下的形态基本是一样的，但其功能各异，对 T 细胞、B 细胞和酝细胞及其有关的亚群的相应表面标志检测，藉以判断机体的免疫水平。,一、T 淋巴细胞表面标志的检测T 细胞表面标志 抗体致敏细胞花环法免疫细胞化学法免疫荧光法T 细胞亚群检测,2018/7/28,T 细胞表面标志T 细胞是参与机体细胞免疫反应和在免疫应答反应中起主导调节
7、作用的一组免疫细胞。所有的 T 细胞均有共同的标志性抗原，不同功能的 T细胞亚群又具有各自的标志性抗原。最常用单克隆抗睐鉴定和检测计数 T 细胞及亚群的表面标志抗体致敏细胞花环法用相应的抗 CD3 单克隆抗体吸附于醛化的红细胞(致敏)，当其与受检 的细胞混匀后，结合有兰细胞的单抗与待测细胞上的 CD3 抗原结合形成桥 联，由于加入的红细胞多于受检细胞，阳性的受程细胞能与致敏的红细胞 结合而形成玫瑰花样的花环，凡受检细胞周围黏附 3 个和 3 个以上红细胞 牵为花环形成细胞，计算花环形成细胞与计数淋巴细胞之比。,2018/7/28,免疫细胞化学法通常以酶作为抗体标记物，采用细胞酶免疫组化技术完成
8、，并常采用生物素一链霉亲合素放大系统提高灵敏度。该类方法可用普通显微镜观察， 凡着色的细胞即为相应 CD 抗原阳性的细胞，计算阳性细胞占总计数细胞的 百分率进行定量分析。免疫荧光法本法是将分离得的外周血单个核细胞与相应的以荧光物质标记的 CD 单 克隆抗体作用(直扫法)，或与抗相应 CD 单克隆抗体作用后，洗去游离的抗 体，继而加入荧光素标记的抗小鼠 IgG 抗皿清，经温育结合后，洗去多余 的标记抗体(间接法)，制片后用荧光显微镜观察结果，计算阳性细胞占总 计数细胞的百分率。如有条件，采用流式细胞仪计数，结果客观准确。,2018/7/28,T 细胞亚群检测采用三色标记单克隆荧光抗体标记单个核细
9、胞悬液，用流式细胞仪进 行检测分析，可对 T 细胞及亚群作出精确分类。,2018/7/28,免疫细胞定量检测，如T淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8等）检测，能精确观察免疫细胞数值变化，评估免疫状况。通常采用流式细胞仪法，特别针对CD4细胞检测，此方法已被称作“金标准”。,T淋巴细胞亚群检测,T淋巴细胞检测,免疫细胞活性检测，如T淋巴细胞转化实验，根据淋巴细胞转化程度测定免疫应答功能，但功能检测仍需结合细胞定量检测，结果更可靠。,流式细胞仪,T细胞表面标志及其亚群,T细胞有两大亚群：CD4+ CD8+根据具体功能有分不同亚群：Td Ti Th Tc Ts受抗原或细胞因子激活就是活化的T细胞不
10、同的活化细胞功能不同：Tc活化后成CTL主要杀伤被病毒感染的细胞或癌细胞，Ts活化主要抑制B细胞产生抗体和其他T细胞的分化，起调节免疫作用，Td活化则适当多种淋巴因子导致炎症，排除抗原，Th也主要协助其他免疫细胞发挥功能，是免疫应答必不可少的。,2018/7/28,T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8- 辅助性T细胞（help T cell,Th）CD3+CD4-CD8+ 细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL）CD4+CD25+ 调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）,2018/7/28,17,SmIg、Fc受体、补体
11、受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,B细胞表面标志,18,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。,NK细胞表面标志,19,流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。 流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒（如细菌）等进行快速定量分
12、析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。 将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18106 细胞/h)的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。,FACS,流式细胞术在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺
13、液，洗脱液，实体组织，培养细胞，微生物,2018/7/28,流式细胞术检测样本,0.4um,40um,流式细胞术检测指标,流式细胞术提供的信息： - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度,细胞结构细胞大小细胞粒度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡,在上述信号基础上的细胞分选,流式细胞术的应用,流式细胞仪组成,液流系统：形成层流系统，聚焦细胞光学系统：产生和收集光学信号电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理,25,荧光激活细胞分离仪分离法,2
14、018/7/28,光学系统,激发光学系统包括:- 激光器- 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域收集光学系统包括:滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器,光学系统,激发光学系统包括:- 激光器- 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域收集光学系统包括:滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器,悬浮状态的细胞单个流过流动室细胞被激发产生散射光和荧光 信号信号被采集转换成数字信号存储于电脑上,液流系统,光学系统,电子系统,前向散射光 forward angle light scatter FALS、FSC、FS 光学检测器在入射光的正前方所收集的低角度光信号,与细胞或颗粒的大小和体积有关。侧向
15、散射光 side scatter, SSC 光学检测器在入射光的直角处所收集的细胞散射的光信号,与细胞或颗粒的内部和表面结构复杂程度有关,如细胞质颗粒性、膜不规则性及核形等。,2018/7/28,荧光强度 fluorescence intensity 结合到细胞或颗粒上的荧光素的量。荧光信号的通道数越大提示荧光强度越强。在恰当的条件下,荧光强度与一个细胞和特定荧光素相结合的位点数相关。自发荧光 autofIuorescence 未染色细胞白身发出的荧光。通常由嘧啶和黄素核苷酸所产生,自发荧光的强度取决于激发光的波长,且随所分析细胞的类型和(或)细胞活化状态而改变。通过特殊的标本处理方法可以降低
16、自发荧光的强度(如用结晶紫孵育)。,2018/7/28,颜色补偿 coIor compensation 由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射的波长范围内而造成荧光信号重叠，通过在其他荧光信号中扣除已测定荧光信号的一部分而纠正颜色重叠造成的计数错误。扣除的荧光量是用恰当的单染对照来确定的。被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。设门 gate 在流式细胞仪显示的象限图上基于一组参数(如荧光对SSC、FSC/SSC等)来确定的所要分析的目的细胞群。对限定区内的目的细胞群通过其他参数(如荧光参数)进一步分析其表达情况。,2018/7/28,数据采集,三种数据： - 前向散射光FSC - 侧向
17、散射光SSC - 各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4,当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的,数据采集-前向散射光,当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生， 可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密切相关,数据采集-侧向散射光,外周全血细胞散射光双参数点图,颗粒杂质、气泡对检测的影响,细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光荧光物质被激发以后产生的发射光将
18、由特定的荧光通道来接收特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的,数据采集-荧光信号,荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关,数据采集,电压,信号放大方式：log、lin信号类型：A,W,H电压的调节:根据阴性对照管来调节,阈值,可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值大多数样本都可以设定FSC/SSC阈值以下的信号不存储根据阴性对照管来调节目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号,补偿,补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动补偿。补偿的调节:根据单染对照管来调节,数据分析,流式数据直方图散点图等高线图密度图三维图统计数据,直方图,直方图(Dist
19、ribution Histogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。,散点图,散点图(Dot Plot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,等高线图和密度图,三维图,统计数据,Events百分比平均荧光强度荧光中位值CVSD,数据获取与分析,电压阈值补偿,获得数据,画图设门统计,荧光素标记的单克隆抗体 采用荧光素直接标记的单克隆抗体(单抗)，称直标抗体。选择直标抗体是淋巴细胞亚群分析的关键步骤,要考虑所选抗体对细胞的反应性。单抗 CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、C
20、D56。,2018/7/28,单抗对细胞的反应性 CD45表达于所有白细胞; CD3表达于T淋巴细胞; CD4表达于T辅助/诱导淋巴细胞(CD4+T细胞)和单核细胞; CD8表达于细胞毒T细胞(CD8- T)和NK细胞; CD19表达于B淋巴细胞; CD16表达于NK细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞等; CD56表达于NK细胞和细胞毒T细胞。,单抗对淋巴细胞亚群的鉴定CD4、CD8、CD16和CD56单抗均不能特异性标记淋巴细胞某一亚群。采用CD45和(或)CD3作为设门抗体,同时兼做质控试剂。CD3+ T细胞标记为CD3 +,CD4+T细胞标记为CD3 + CD4+ CD8+ T细胞标
21、记为CD3+ CD8+B细胞标记为CD3 -CD19 +NK细胞标记为CD3 - CD56+ 或 CD3 CD(16+56)+,2018/7/28,直标抗体常用荧光染料 异硫氰酸荧光素(FITC) 藻红蛋白(PE/RD1) 藻红蛋白偶联物(PECY5) 多甲藻叶绿素蛋白(PerCP) 藻红蛋白-德州红偶联物(ECD) 别藻青蛋白(APC) 除别藻青蛋白(APC)外,其他荧光染料均采用488nm的激发光源激发,最大发射波长分别为525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。 别藻青蛋白(APC)的激发光源为630nm,最大发射波长为660nm。,2018/7/28,溶血素 使用与仪
22、器相匹配的溶血素(内含固定液),并严格按照使用说明和注意事项进行操作。如果使用没有固定作用的溶血剂(如氯化铵和低渗缓冲液等),染色后标本需要保存在4 ,并在1h内完成上机固定液 0.1%-2.0%多聚甲醛或甲醛缓冲液是常用的固定液,用于对感染的标本在分析前进行灭活,能够灭活HIV 等病毒的3个-5个对数级的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多聚甲醛或甲醛缓冲液(Ph7.0-7.4)处理,4 保存待测。,2018/7/28,56,流式细胞分析仪,1973年BD公司与Stanford University合作开发世界上第一台商用流式细胞仪FACSI。1980年北京师范大学引进中国第一台
23、流式细胞仪FACSIII。,实验应用流式细胞仪主要有两个最基本的用途：可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，进行特定的活细胞群的分离和纯化。,2018/7/28,免疫细胞群的分类 静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。 B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。 T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分
24、为不同的群或亚群。,2018/7/28,免疫细胞的分化发育 免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。 如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。,2018/7/28,免疫细胞的分子表达 免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分
25、化状态等。 静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。 可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。,2018/7/28,器材10ml 圆底试管，FACs专用离心管，滴管，吸管血球记数板，盖玻片4冰箱，离心机，流式细胞仪试剂抗凝全血、淋巴细胞分离液荧光素标记抗体FACs缓冲液Hanks液,2018/7/28,操作步骤抗凝全血2ml，加Hanks液2ml稀释。取淋巴细胞分离液2ml置10ml试管，用滴管将稀释全血沿管壁徐徐铺于分离液界面上。于水平式离心机中离心2000rpm，20分钟。用滴管吸取界面白色细胞层，移入尖
26、底离心管中。加入足量Hanks液，充分混匀后离心1000rpm，10分钟，离心后弃上清液，将试管底部细胞充分叩匀，再用Hanks液洗涤1遍。加1ml Hanks液重悬浮细胞，计数后取1106细胞至FACs专用试管，离心1500rpm，5分钟，弃上清。叩散细胞后，加0.1ml荧光素标记抗体，震荡混匀，冰浴30分钟。加FACs缓冲液至足量，混匀，离心1000rpm，10分钟，弃上清，再重复用FACs缓冲液洗涤1次。加FACs缓冲液0.5ml悬起细胞。流式细胞仪检测。,2018/7/28,全血法测CD3、CD4、CD8步骤：吸取抗凝全血100l，加入含5l单抗混合液的1.5ml离心管中；混匀，室温避
27、光孵育20分钟；加溶血素1ml，颠倒混匀，室温避光裂解红细胞10分钟；1500rpm/min离心5分钟，弃去上清液；加PBS 1ml，颠倒混匀，1500rpm/min离心5分钟，弃去上清液；加PBS 400l，颠倒混匀，移入FACs专用检测管待检。,2018/7/28,2018/7/28,临床意义CD4+T细胞减少：常见于恶性肿瘤、 遗传性免疫缺陷症、 艾滋病、 应用免疫抑制剂等。CD8+T细胞：增多见于系统性红斑狼疮、 慢性活动性肝炎、 传染性单核细胞增多症、 恶性肿瘤及其他病毒感染等。降低见于类风湿性关节炎、 糖尿病等。CD4+T/CD8+T比值：降低见于传染性单核细胞增多症、 急性巨细胞病毒感染、 再生障碍性贫血、 骨髓移植恢复期、 肾病等，艾滋病患者的 CD4/CD8比值多在0.5以下。增高见于移植后发生排异反应、 类风湿性关节炎 、 糖尿病等。,谢 谢 ！,
