1、毕业论文文献综述水产养殖细胞色素CO的研究概述摘要本文简述了细胞色素C氧化酶（CO）的结构功能，总体介绍了CO的研究现状，并在分子生物水平的基础上，主要论述了CO基因序列差异的研究在遗传学和病害学上的影响，特别是其在鱼类分类鉴定上所发挥的重要作用。关键词鱼类；细胞色素C；CO；基因序列在生物的线粒体中广泛存在着一种具有自动氧化作用的物质，即细胞色素氧化酶CYTOEHROMEOXIDASE,COX。COX由13个亚基组成，其中最大的3个亚基（CO1、CO2、CO3）来源于线粒体，其序列具有高度的保守性，分别由2个线粒体基因编码CO1和CO2是COX的两个催化中心（钟涛等，2002）。CO作为细胞
2、色素C氧化酶具有酶催化活性的3大亚基之一，是MTDNA编码的最大亚基（谭小玲等，2002），且分子结构简单，检测便捷，具有严格而又典型的母性遗传，难以发生重组，可用于种群间、种、属间甚至科间的系统发育等研究（肖武汉等，2000）。1研究背景1930年，英国生物化学家凯林在心肌提取物中就已经发现细胞色素C氧化酶在电子传递链上的活性。2003年初，加拿大圭尔夫大学的生物学家保罗赫伯特PAULHEBERT和他的同事在英国皇家学会学报B辑上发表了一篇论文，提出用细胞色素C氧化酶I基因片段作为鉴别不同物种的“条码”。十年前，用一种简便易行的方法把物种一一归类似乎是一项不可能的任务，但21世纪以来，随着基
3、因工程的突破性发展，人们开始在分子水平上了解细胞色素C氧化酶的分子结构，发现细胞色素C氧化酶具有很大的保守性，而细胞色素C氧化酶基因序列进化速度适宜，把它的基因片段制成DNA条码最为适合，从而让地球上所有的物种都能拥有一份独特的“身份证”，用以辨别各自属于哪种种类，而且还能用其推测出分类阶元间的系统发育关系（OSTERMEIERCETAL，1996；WUWETAL,2000；李连之等，2001；王中华等，2010）。鱼类是脊椎动物中最原始而在种属数量上又最占优势的类群，其物种繁多，分布广泛，起源复杂，研究其遗传分化，阐明其进化途径，历来是令人饶有兴趣的课题。近年来，随着分子生物学技术向生物学各
4、研究领域渗透，从分子水平，研究鱼类的遗传与进化，已越来越引人注目。其中对鱼类CO的研究将会影响到其分类学，遗传学及疾病学的发展，能为渔业资源有序利用和保护提供参考，又因为鱼类的分类鉴定蕴含着巨大的利益，因此将会有越来越多的人对鱼类CO感兴趣（杨学明等，2006；杨天燕等，2007）。2研究现状21鱼类分类学方面多年以来，生物分类学家一直在寻找能够迅速区分不同物种的方法。传统的分类学鉴定依赖于针对物种外观或者解剖特征的识别，这种方法既费时费力，又可能出现错误。传统分类学并不能准确具体地分类鉴别出生物种类。有时传统分类划分的同一物种却属于几个物种。如传统分类学认为的哥斯达黎加一种蝴蝶，用COI基因
5、片段检验却鉴定出其中包含了十几个属。如果每一个物种都携带有表明自己身份的“条码”，那么物种分类和鉴定工作将得到很大简化。CO是生物分子系统学研究和群体遗传分化的重要标志，其进化速度适宜且有较大的保守性，COI的基因约650个碱基，很适合作为动物分类学与生态学的DNABARCODE（MURGIARETAL，2002）。虽然采用COI基因作为DNABARCODE所隐含的涉及线粒体的进化历史、遗传特性和物种成种时间的默认前提并非完全成立，但目前在动物中最常用的DNABARCODE就是细胞色素C氧化酶1号基因（COI）的部分序列（关申民等，2000）。且随着标准数据库的建立，基于COI基因的DNABA
6、RCODE在动物分类学和生态学中得到了广泛应用。近年来，COI作为扫描生命的条码，已被广泛用于鱼类、昆虫、鸟类等动物的鉴别分类研究。现今，因COI条码序列获取很便捷，广泛适用硬骨鱼类物种鉴别，并可用于低级分类阶元的系统进化分析（刘楚吾等，2009），如由青石斑鱼CO与线纹刺尾鲷CO同源性很高，可判断青石斑鱼与线纹刺尾鲷亲缘性很高（施大卫等，2009）；对采自东海的银鲳、翎鲳和中国鲳3种鲳属鱼类的线粒体COI基因序列片段进行研究，能从分子水平研究中国东海海域鲳属鱼类的分类、遗传关系和系统进化，以其了解鲳属鱼类以及与鲳科之间的亲缘关系，又为鲳属鱼类保护生物学和系统进化提供分子生物学依据（张凤英等，
7、2008）；更有人研究了基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用（彭居俐等，2009）。因此，虽然现在对于用COI基因片段作为鱼类分类鉴定的DNABARCODE研究较少，但鱼类资源保护日益严峻，以CO基因序列为DNABARCODE的鱼类分类鉴别将被频繁用到，并可完善甚至改变鱼类传统分类。22鱼类遗传学方面由于COI无论在鱼类还是其它动物体内都参与了重要的生命活动，其基因序列高度保守，在高氧或缺氧环境中都会影响COI基因序列的表达。另外，在物种遗传过程中发生的基因重组也必定会使COI基因序列发生差异，因而可以利用COI还可以推测出个体在种群内是否发生了基因变异。如研究
8、钉螺子一代的COI基因序列差异可得知子一代钉螺内的核苷酸发生了变异（张仪等，2005）。COI还是参与细胞凋亡的细胞色素C的一大部分，因此研究细胞凋亡过程中发生的基因变异可从COI入手。主要因为CO是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3大亚基之一，而细胞凋亡是动植物最基本的一种生命活动,是一个有一系列酶参与，并且由基因控制的主动的、高度有序的死亡过程。线粒体除了为细胞提供能量外，在细胞凋亡中也起着中心调控作用。线粒体释放的细胞色素C是细胞凋亡过程的关键因素，细胞色素C从线粒体释放的机制及在凋亡中起着重要作用（许守明等，2009）。23鱼类疾病学方面细胞色素氧化酶在动物内分布十分广泛，它的突变与疾
9、病发生有密切的关系，通过分析线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因的结构特点及其突变引起的主要疾病症状，对动物疾病诊断有很大帮助柏干荣等，2003。近年来，由于在临床药物治疗上频繁用到细胞色素C生化制品，人们对细胞色素C的研究较多，细胞色素CO与疾病的关系也越来越吸引人们的目光。如比较中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C亚基I基因序列，可在分子水平上研究不同地理株登革病毒易感性的差异（陈虹等，2003）。更有研究表明，CO1和CO2基因突变造成阿尔茨海默病AD患者COX缺陷的主要原因，而磁场辐照可能通过影响COI的基因转录水平，而使COX活力降低。由于COX的缺陷可以使神经元功能状态发生改变，有人
10、设想磁场导致的神经元变性引起的AD病或脑瘤发生与磁场影响CO1基因转录有关（钟涛等，2002）。现今，鱼类的大部分疾病还缺乏有效的防治方法，在有限的海域进行高密度养殖时又极为容易出现严重的鱼类传染病，导致水产养殖业受到严重损害，所以研究鱼类COI的基因序列差异对其病害的防治必定起着重要的作用。3研究方法以下介绍一种常用鱼类CO的实验研究方法（SHAKLEEJB，1982；GASSERBETAL，1999；董云伟等，2002；李铁华等，2003；张新宇等，2004；陈峥宏等，2009；戴荣四等，2009；）样本采集从市场上选购健康的几种亲缘性较近的鱼类作为样本，并对其进行养殖备用。DNA的提取解
11、剖样本，提取样本的肌肉，再从样本肌肉中提取DNA，用电泳和紫外线分光光度计测量DNA的浓度和质量，进行低温保存。引物设计用PRIMER5OROLIGO6软件，根据相近鱼类CO及上下游序列保守序列设计引物。CO克隆测序PCR扩增各自鱼类的CO基因，然后PCR产物进行克隆，最后送往测序公司测序。CO基因序列分析使用程序软件分析得出的CO基因序列的结构域，构建出进化树，评估样本鱼类的进化关系。4研究前景由于COI基因来自线粒体，它的拷贝数量更多因为一个细胞只有一个细胞核，却有许多线粒体，对其克隆和测序比较简单。测出一份样本中的COI基因的序列之后，把它们与已经测定完成的序列相比较，就可以知道该样本是
12、否属于某个已知物种，而不需要利用传统的分类学方法进行鉴定。更重要的是，DNA条码领域迅速兴起是因为存在对物种鉴别的巨大需求，同时DNA条码已被证明可以提供有效的身份识别。所以利用COI基因为鱼类等动物建立DNA条码将是未来几年的一大发展趋势，用其作为动植物自动化识别分类的前景存在着巨大的商机。参考文献1柏干荣,陆松敏线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因突变与疾病J国外医学分子生物学分册,2003,2343933952陈虹,陈汉彬中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基1基因序列比较中国流行病学杂志2003,2461911933陈峥宏,郎书源,吴晓娟,等用COX1基因片段的PCR鉴定亚洲带绦
13、虫和牛带绦虫J贵阳医学院学报,2009,3432392414戴荣四,李芬,刘伟,等湘西地区山羊多头蚴感染调查与种类鉴定J中国人兽共患病学报,2009,2543913945董云伟,牛翠娟,鲍蕾,等单只轮虫DNA提取及其细胞色素C氧化酶I亚基部分序列测定动物学研究,2002181836关申民,高邦权COI序列影响动物分类学与生态学的DNABARCODE生态学杂志,2008,278140614127李连之,黄仲贤细胞色素C氧化酶研究新进展J无机化学学报,2001,1767617748李铁华,郭湘荣,胡铃,等我国五省美洲钩虫COI基因序列多态性分析中国寄生虫病杂志,2003,2142102139刘楚吾
14、,刘丽,王中铎,等军曹鱼的分子遗传特性研究热带海洋学报,2005,241778510彭居俐,王绪祯基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用J水生生物学报,2009,33227127611施大卫,王利,娄绘芳,等青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基COX基因的克隆鉴定及表达分析J中国水产科学,2009,160446847512谭小玲,柳君泽,曹利飞,等缺氧对大鼠大脑皮质细胞色素氧化酶亚基、表达协同性的影响生理学报,2002,54651952413王中华,应天雷,黄仲贤细胞色素C突变研究进展J化学通报,20101313614肖武汉,张亚平鱼类线粒体DNA的遗传与进化J水生生物学
15、报,2000,24438439115许守明,陈双喜何艳霞细胞凋亡与细胞色素C安徽农学通报,2009,15153816杨天燕,高天翔3种鲻科鱼类线粒体CO基因片段序列的比较分析J中国海洋大学学报,2007,37SUP06106617杨学明,郭亚芬罗氏沼虾3个群体线粒体CO基因的序列差异和遗传标记研究遗传,2006,28554054418张凤英,夏连军黄鲷线粒体CO基因部分序列遗传变异研究热带海洋学报,2005,245838919张新宇,高燕宁PCR引物设计及软件使用技巧生物信息学,2004,24151920张仪,刘和香,冯婷,等子一代实验室钉螺细胞色素C氧化酶工、细胞色素B基因序列分析中国寄生虫
16、学与寄生虫病杂志,2004,22527427621钟涛,陈苘,吴瑞英,等极低频磁场对细胞色素氧化酶亚基1基因转录水平的影响中华劳动卫生职业病杂志,2002,20124925122GASSERB,ZHUX,MCMANUSDPNADHDEHYDROGENASESUBANITANDCYTOCHROMECOXIDASOSUBUNITSEQUENCESCOMPAREDFORMEMBERSOFTHEGENUSTAENIACESTODAJINTJPARASITOL,1999,29121965197023MURGIAR,TOLAG,ARCHERSN,ETALGENETICIDENTIFICATIONOFGRE
17、YMULLETSPECIESMUGILIDAEBYANALYSISOFMITOCHONDRIALDNASEQUENCEAPPLICATIONTOIDENTIFYTHEORIGINOFPROCESSEDOVARYPRODUCTSBOTTARGAJMARINEBIOTECHNOLOGY,2002,4411912624OSTERMEIERC,IWATATS,MICHELHCYTOCHROMECOXIDASECURROPINSTRUCTBIOL,1996,646046625SHAKLEEJBSPECIATIONANDEVOLUTIONOFMARINEFISHESSTUDIEDBYELECTROPHORESISANALYSISOFPROTEINSJPACSCI,1982,3614115726WUW,SEHMIDTTR,GOODMANM,ETALMOLECULAREVOLUTIONOFCYTOCHROMECOXIDASESUBUNITINPRIMATESISTHERECOEVOLUTIONBETWEENMITOCHONDRIALANDNUCLEARGENOMESJMOLPHYLOGENETEVOL,2000,172294304
