1、毕业论文文献综述生物技术测定水产品中的磺胺类抗生素残留研究摘要兽药残留直接影响着动物源食品安全问题，渔药残留是影响水产品食品安全的重要因素之一。不仅需要从从源头上控制渔药的使用，还需要建立快速分离样品中痕量的检测物、提高分析方法的精确度和灵敏度以及建立快捷、经济、准确的检测技术。本文介绍了分子印迹技术，及分子印迹聚合物的应用，基质固相分散技术和液相色谱法技术及应用。并介绍多种方法联用，避开单方法的缺点，集众方法优点于一身，来满足日益增长的水产品进出口检疫。关键词分子印迹；基质固相分散；液相色谱法；磺胺类抗生素；水产品0引言随着经济全球化和食品贸易国际化发展，食品安全已成为一个世界性的挑战和全球
2、重要的公共卫生安全问题，其中兽药残留是影响动物源食品安全的重要因素之一，主要的兽药残留有抗生素类、磺胺类、呋喃药类、激素药类等。渔药即渔用药品的简称，是兽药的一种，渔药残留是影响水产品类食品安全的主要因素之一。渔药是用于预防、控制和治疗鱼病的药物，因磺胺类抗微生物药物具有抗菌范围广、杀菌能力强等优点，是防治水产动物细菌性疾病的主要渔药药物1。施用渔药是渔业生产养殖中，为预防和控制鱼类病害，减少养殖损失，提高经济效益的一项必需的工作。我国是水产品出口大国，2009年中国水产品出口量2942万吨，出口额107亿美元，水产品质量安全问题直接关乎检疫是否通过。近几年来，我国频频发生的食品安全问题，兽药
3、残留不仅给水产养殖自身带来影响，如造成鱼类肝脏肿大、腹水等死亡现象，引起水产类的耐药性；还对人体产生危害，如食用后诱导人体产生耐药性，药物在人体累积后容易引起人体过敏或中毒，器官的损害甚至会致突变、致畸、致癌等，而且还影响着动物源食品在国内、国际间的正常贸易2。为避免这种情况的发生，除了从源头上控制兽药的使用之外，如何快速分离复杂样品中痕量的检测物、降低检测低限、提高分析方法的精确度和灵敏度以及建立快捷、经济、准确的检测技术，也是一项重要的工作。1磺胺类抗生素磺胺类药物是由磺胺衍生的一类化合物，是一类广谱抗菌性物质，广泛用于人和家畜、鱼类细菌性疾病的防治。磺胺类抗生素是一类化学合成的抗生素，它
4、对多数革兰氏阳性菌、阴性球菌有抑制作用，抗菌谱广，抗菌作用强，适用于治疗各类感染，具有良好的效果。在当代畜牧生产和水产养殖中得到了广泛应用，对水产养殖中的细菌性竖鳞病、烂鳃病、弧菌病、赤鳍病、肠炎、鞭毛虫病等有良好的防治效果3。但也带来了磺胺类残留和环境污染等一系列问题。因其危害日益严重，国内外均对磺胺类的残留有限量标准。国际食品法典委员会CAC规定，食品和饲料中磺胺类药物总量以及磺胺二甲基嘧啶等单个磺胺类药物的量均不得超过01MG/KG。我国规定磺胺类药物总量不得超过03MG/KG4。动物性食品中抗生素残留量的测定方法很多，包括分光光度法、示波极谱法、荧光光度法、毛细管电泳法、高效液相色谱H
5、PLC、气相色谱GC、高效液相色谱质谱HPLCMS法等。磺胺类抗生素的分析方法有HPLC、GC、酶联免疫法、气相色谱质谱GCMS、液相色谱质谱LCMS等。5酶联免疫法作为筛选方法得到广泛应用，但容易出现假阳性，现在较少采用。液相色谱方法在磺胺类抗生素残留的检测中灵敏度较低，选择性差，在低浓度时受干扰较大。液相色谱质谱法可有效减少背景干扰，提高灵敏度，定性准确，是磺胺类抗生素残留检测的常用方法之一。分子印迹和与分子印迹相联用的技术也是常用的方法。2分子印迹技术在兽药残留检测中的应用21分子印迹技术分子印迹技术是通过人工合成手段获得在空间结构和结合位点上与模板分子或印迹分子完全匹配、具有分子识别功
6、能的聚合物的一种新型实验制备技术。分子印迹技术的基本思想是基于对抗体抗原或酶的专一性的认识，即一种抗体只能针对一种抗原，一种酶只能选择性地催化一种或几种类似的底物。6分子印迹聚合物（MIP）的制备过程第一步以具有适当功能基的功能单体与印迹分子或模板分子结合形成非共价单体印迹复合物。第二步，选择适当的交联剂或与惰性溶剂、致孔剂一起加入，引发聚合反应，将功能单体互相交联起来形成刚性的共聚物，从而使功能单体上的功能基在空间排列和空间定向上固定下来。第三步通过一定的方法把印迹分子脱去。这样就在高分子共聚物上保留特异性的结合位点，其结构和功能与印迹分子互补，并含有与印迹分子专一结合的功能基的三维空穴构象
7、。这个三维空穴构象可以选择性地重新与印迹分子结合，从而对印迹分子具有专一性的识别作用。分子印迹聚合物具有预定性、识别性、实用性等特点，适合于复杂样品的前处理。7所以以分子印迹聚合物为基质进行生物物质分析、检测、分离与纯化所涉及的范围很广，可应用于氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、药物等领域。近年来，分子印迹聚合物在兽药残留分析领域被广泛研究。22在兽药检测中的应用目前，将分子印迹技术应用到食品安全检测领域成为国内外研究的热点，分子印迹聚合物在兽药残留检测方面的应用主要体现在两方面制备固相萃取柱以分离和富集痕量组分；制备识别元件以快速检测动物体内的兽药残留。主要被用于固相萃取、传感器、色谱分离等方面。
8、221分子印迹固相萃取固相萃取是兽药残留分析常用的样品处理与富集方法。常规的基于反相或离子交换作用的固相萃取技术在兽药残留检测应用中往往选择性较差，给后面的仪器分析造成困难，带来较大的误差8。分子印迹聚合物固相萃取可克服生物样品体系复杂、预处理手续繁琐等不利因素，用于特定目标化合物的采集和富集，除去大部分干扰组分，从而方便仪器分析，为食品安全检测中样品的制备尤其是痕量物质的分析提供了极大的方便。另外，分子印迹聚合物固相萃取柱具有稳定的立体空穴结构，作用原理不同于传统固相萃取柱，可反复使用，从而可以降低检测成本。陈小霞等制备了氯霉素MISPE柱，用于生物制品和动物性食品的检测，效果较好9。222
9、分子印迹传感器分子印迹聚合物理化性质稳定性高，不受酸碱、有机试剂以及环境等因素的影响，又具有较高的分子识别特性，所以分子印迹聚合物非常适合作为传感器的识别元件。应用分子印迹聚合物取代天然物质制备的传感元件具有较高的优势，使传感器在保持高的选择性和灵敏度的同时，耐受性也提高了，使用寿命延长。目前己用分子印迹聚合物膜传感器测定的对象有氨基酸衍生物、除草剂、神经毒剂水解产物等化合物10。223色谱分离分子印迹聚合物主要是作为色谱固定相，特别是用于手性固定相。分子印迹聚合物作为色谱固定相的突出优点是可预测洗脱顺序。快速高效的毛细管电色谱与有预测能力的高亲和性分子印迹聚合物相结合，成为一种高效的选择性分
10、离手段。李更生等成功合成了克伦特罗分子印迹聚合物，用于兽药中克伦特罗的检测分析，表现了较大的吸附性能和良好的检测效果11。3基质固相分散基质固相分散技术MSPD是一种样品检测提取的新方法。具有方便快捷、样品和溶剂用量少等优点被广泛应用于兽药残留的分析。耿志明等建立的用基质固相分散技术对样品进行前处理，然后与高效液相色谱仪联用，经05乙酸溶液甲醇混合流动相梯度洗脱，对鱼肉中磺胺类药物残留进行检测。操作简单、方法稳定，具有理想的准确度和灵敏度，可用于磺胺类药物的定量分析。基质固相分散常用的吸附剂主要为硅藻土和硅胶，但选择性较差。分子印迹聚合物是具有高选择性等特点，适合于复杂样品的前处理。王荣艳等建
11、立的以氯霉素分子印迹聚合物为基质固相分散吸附剂提取牛奶中氯霉素残留的方法，实验表明该方法无需固相萃取技术净化可有效消除样品基体对氯霉素的干扰，并且该方法灵敏度高，精确性高，能够满足当前国际上对氯霉素残留量检测的要求12。4液相色谱法高效液相色谱法是检测磺胺类药物常用的方法，并且多用于磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等几种磺胺类药物的同时检测。过去样品的前处理多采用固相萃取法，因操作较繁琐，耗时长等缺点被逐渐淘汰。高效液相色谱法检测水产品样品的提取、净化等前处理简捷、快速、准确。陈振桂等建立同时测定鳗鱼、鮰鱼、龙虾等水产品中13种磺胺类药物残留的高效液相色谱法，采用乙腈提取，高效液相色谱分离，紫外检测器检
12、测，外标法定量，取得较好的效果。林海丹等采用固相萃取前处理技术作为样品萃取物的净化富集，建立固相萃取高效液相分析鳗鱼及其制品中磺胺类药物的残留量。该法简便、准确，已应用于广州口岸出口鳗鱼与烤鳗的实际检验中，效果显著1315。高效液相色谱法与其它技术联用，可以集众多优点于一身。如孙伟红等将高效液相色谱法与串联质谱法联用，同时测定水产品中18种最常见的磺胺类药物残留，能一次性完成这18种磺胺类药物的定量和确证性分析，不仅大大提高了色谱分析的效率，降低了分析成本，还实现了药物残留的快速检测，方法的灵敏度完全可以达到出口限量要求1618。杨琳等建立的高效液相色谱质谱联用技术可同时测定常用渔药大蒜素中1
13、4种磺胺类抗生素的残留1922。刘正才等建立的快速测定鳗鱼中26种喹诺酮类和磺胺类抗生素药物残留量的超高效液相色谱电喷雾串联质谱方法。采用乙腈二氯甲烷混合溶剂提取样品中的残留物，经固相萃取小柱净化，以液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量。该方法具有快速、准确、适用范围广等优点，在福建地区进出口水产品检验检疫中得到应用，对水产品中喹诺酮类和磺胺类抗生素快速筛选与确证取得满意的效果2324。参考文献1巢磊，磺胺类药物在水产养殖中的应用J水利渔业，2002，22350512李佐卿，倪梅林，俞雪钧等液相色谱串联质谱法检测水产品中磺胺类和喹诺酮类药物残留J分析测试学报，2007，2645085103陈振桂
14、，占春瑞，郭平等高效液相色谱法同时测定水产品中13种磺胺类药物残留的研究J食品科学，2007，28104484514孙玉增，徐英江，刘慧慧等液相色谱串联质谱法测定海产品中21种磺胺类药物残留J食品科学，2010，3121201235张海琪，宋琍琍，徐晓林等液相色谱串联质谱法同时测定大黄鱼中20种磺胺类药物残留J分析化学研究简报，2007，3522682726徐小艳，田兴国分子印迹技术在食品安全检测中的应用J广东农业科学，2008，111081107何东旭，陈玎玎，祁克宗等分子印迹固相萃取在兽药残留分析中的研究与应用J兽药与饲料添加剂，2008，13420238朱馨乐，孙雷，刘琪分子印迹技术在兽
15、药残留检测方面的研究进展J中国兽药杂志，2007，41634379陈小霞，岳振峰，郑卫平等氯霉素分子烙印固相萃取柱的制备及萃取条件优化J华南理工大学学报，2004，327515510耿志明，李鹏，陈明等基质固相分散高效液相色谱法测定鱼肉中磺胺类药物残留J江苏农业学报，2006，22331031211李更生，尚红霞，刘婕等克伦特罗分子印迹聚合物吸附性能研究J化学与生物工程，2005，6283012王荣艳，王培龙，佘永新等分子印迹基质固相分散液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留J分析试验室，2009，288262813林海丹，谢守新，吴映璇高效液相色谱法同时测定鳗鱼及其制品中八种磺胺类药物J食品科学，
16、2005，2617617914孙伟红，冷凯良，王志杰等HPLCMS/MS内标法同时测定水产品中18种磺胺类药物残留量J食品科学，2009，302429429815杨琳，邹红梅，温裕等高效液相色谱质谱同时测定大蒜素渔药中的14种磺胺类抗生素J厦门大学学报，2007，46229329616刘正才，杨方，李耀平等UPLCMS/MS对鳗鱼中26种喹诺酮类及磺胺类抗生素药物残留的快速测定J分析测试学报，2008，27111171117517NANCYTM，MUSTAFAAMDETERMINATIONOFSULFONAMIDESINSELECTEDMALAYSIANSWINEWASTEWATERBYHIG
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18、NQUANTITATIVEDETERMINATIONOFTHREESULFONAMIDESINENVIRONMENTALWATERSAMPLESUSINGLIQUIDCHROMATOGRAPHYCOUPLEDTOELECTROSPRAYTANDEMMASSSPECTROMETRYJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA，2007，115711512120HONGTL，JUNGHHLIGHTANDMICROBIALEFFECTSONTHETRANSFORMATIONOFFOURSULFONAMIDESINEELPONDWATERANDSEDIMENTJAQUACULTURE，2008，
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