1、毕业论文文献综述生物工程蛋白激酶B的研究进展摘要丝苏氨酸蛋白激酶AKT又名PROTEINKINASEB在细胞代谢、细胞存活、细胞周期调控、转录调控等多种生物学过程中发挥着重要作用。该文综述了PKBAKT的结构、活化调节与生理学功能及其抑制剂的研究进展。关键词PKB生理功能抑制剂调节丝氨酸苏氨酸激酶蛋白激酶BPKBAKT的发现已有十多年时间，在近年来的研究中备受关注，其参与某些生长因子或淋巴因子诱导的靶细胞应答，影响胞内糖类的转运、糖原的合成及蛋白质的合成抑制细胞凋亡等1。PKB是机体维持正常生命活动的一个重要调节子。1PKB的结构及定位1991年三个不同的研究小组同时发现PKB蛋白，并证明其激
2、酶活性区的氨基酸组成与PKC和PKA的同源性分别为73和682,是AGC激酶家族的一员3。因此将其命名为PKB或RACPKRELATEDTOTHEAANDCKINASES。此外，有一种寄存于啮齿类动物T细胞淋巴瘤中的反转录病毒AKT8，其VAKT基因编码的AKT蛋白与PKB同源，AKT蛋白是PKB和该病毒的GAG蛋白的融合蛋白，因此PKB又被称为AKT4。PKB存在多种亚型，常见的有AKT1，AKT2，AKT3等，其各亚型在结构上的同源性较高，氨基酸均含一个血小板一白细胞C激酶同源区。PKBAKT为单链的结构，由3个结构域DOMAIN组成第1147位氨基酸构成其N一端的调节区AHDOMAIN，
3、其中第1106位氨基酸构成PH区域PLECKSTRINHOMOLOGY，该区域参与与其他一些蛋白质如G一蛋白亚基及脂类如磷脂酰肌醇之间的相互作用。第148411位氨基酸构成其丝苏氨酸激酶区域（催化区域），与其它丝苏氨酸蛋白激酶有较多的同源性，包含一个保守的苏氨酸位点THR308THR309或THR305。第412480位氨基酸构成其C末端尾部区域，除PKB外，均有一个丝氨酸SER473/474位点58。2PKB的活化与调节AKT能被细胞内多种物质如激素、生长因子、细胞因子、细胞间基质等刺激活化9，其活化可分为P13K依赖和PBK非依赖及其他负调控分子，从而来调节各种的生理活动。21依赖P13K
4、的PKB活性调节1011AKT首先需要转位到质膜上去；其次，AKT的THR308和SER473位点需要磷酸化。激活的PI3K在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDKI结合，诱导无活性的AKT和PDKI从细胞质移位到细胞膜，并获得催化活性，催化自身的SERL24和THR450磷酸化；同时，AKT的构象改变，暴露出THR308和SER473磷酸化位点。转位于细胞膜的AKT与PDKI相互靠近，PDK1催化AKT的THR308磷酸化而部分激活AKT；PDK2再对AKT的SER473位点磷酸化才最后导致其完全活化。活化的AKT引起下游磷酸化级联反应和靶蛋白之间
5、的相互作用12，调控细胞生长与存活、增殖与凋亡糖类代谢等生理活动13。22不依赖P13K的PKB活性调节P13K通路并非AKT激活的唯一途径。胰岛素等刺激因子可通过激活依赖于钙一钙调蛋白激酶直接磷酸化AKT的THR308住点导致其活化。CAMP可通过PKA激活AKT，此过程仅需要THR308的磷酸化，不激活PI3K，HSP27与AKT结合激活其它热休克蛋白，也可调节AKT的活性，这种激活不需PIP3的参与，且不被PBK抑制剂WORTMANNIN阻断。23其他负调控分子磷酸酶和张力蛋白同源物基因（PTEN、肌管素LMTML的SH2结构域SHIPL2能使PIP、PIP2、PIP3降解、转化，为PI
6、3K信号转导终止的负调控分子；C末端调节蛋白CTMP是针对AKTC端的一种负性调节因子14，CTMP能结合AKT并通过抑制AKT的磷酸化而阻断下游信号的传递整合蛋白激酶ILK是重要的AKT活化的上游调节物，虽不直接参与，但能调节SER473磷酸化等。3PKB的生理学功能31葡萄糖代谢15胰岛素与受体结合后，通过PI3K途径主要激活PKB使细胞内特定的GLUT4储存囊泡GSVS释放囊泡相关膜蛋白2，导致GLUT4易位，促进组织摄取葡萄糖16作用于己糖激酶，促进葡萄糖的吸收；糖原合成酶激酶3GSK3是PKB的直接底物，活化的PKB可使GSK3的SER位点磷酸化，导致糖原合成酶不能被磷酸化,糖原合成
7、增加；PKB能够通过作用于低氧诱导因子HIF，促进糖酵解酶的表达，加速糖酵解，从而维持血糖的稳定17。32脂质代谢PKB也是通过磷酸化抑制GSK3，调节脂质代谢。通常GSK3磷酸化其底物后，可导致蛋白酶体的降解。已经发现GSK3能够促进甾醇调节因子结合蛋白SREBP的降解18。SREBP是一类转录因子，可以开启参与胆固醇及脂肪酸合成过程的基因的表达。因此，PKB介导GSK3的抑制作用，可增加SREBP的稳定性，促进脂质的合成。33蛋白质合成代谢PKB在蛋白质合成中的作用是抑制某些蛋白质的合成。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白MTOR能够磷酸化底物核糖体40S小亚基S6蛋白激酶P70S6K和真核起始因子4
8、E结合蛋白I4EBPL，从而活化P70S6K，抑制4EBPL，起始翻译过程。PKB可以磷酸化其SER448残基，活化MTOR，从而减慢蛋白质合成19。34细胞存活PKBAKT通过磷酸化和失活几种促凋亡靶点促进细胞存活，其中包括BCL2相关促死蛋白BAD、胱天蛋白酶9CASPASE9和应激活化蛋白激酶SAPK通路上游激酶。另外，PKB也可以通过作用于转录因子来抑制一些促凋亡蛋白表达，促进细胞存活，其中包括FOXO和P53。例如，PKB可以在胞核内磷酸化FOX01的THR24、SER256和SER319残基；FOX03A的THR32、SER253和SER315残基；FOX04的THR32、SERL
9、97和SER262残基。FOXO被磷酸化后与1433蛋白结合，从目标基因上替代FOXO转录因子，并诱导它们转移出细胞核20。通过这种机理，PKB阻滞那些促凋亡、细胞周期停滞以及代谢过程的目标基因的转录。35细胞周期调控PKBAKT可以通过抑制GSK3而增加周期蛋白DCYCLIND的积累，负调控周期蛋白激酶CDK的抑制剂P27KIPL（是周期蛋白激酶CDK的抑制剂，被PKB磷酸化THRL57残基后与1433蛋白结合，而聚集于胞质中2122）和野生型P53激活中断1P21CIP1WAF1，通过增加鼠双小蛋白2MDM2活性导致P53降解，调控细胞周期。36转录调控PKB在活化后可以由细胞质移位到细胞
10、核内，磷酸化一系列核因子，从而发挥转录调控的作用。这些作用主要表现在1磷酸化FOXO家族转录因子，使转录因子出核，降低转录活性；2促进转录因子K基因结合核因子NFB转录。通常IB使NFB定位于胞质中，IB被上游激酶IKKS磷酸化后降解，使NFB移位到核内，促进靶基因的转录。PKB直接磷酸化IKKA，使IKK激活，调节NFB活性。4PKB抑制剂研究进展41磷脂酰肌醇类似物抑制剂设计合成磷脂酰肌醇类似物，可以当作底物竞争性地与P13K发生作用，抑制P13K磷酸化PTDINS4，5P2的3位羟基，从而减少PTDLNS3，4，5P3的生成。PKB因此无法与PTDLNS3，4，5P3结合而被转移。这种抑
11、制方法可以阻止PKB由胞质向胞膜的转移，从而阻止了它的活化。42假底物抑制剂AKTIDE2T是一个14MET的肽，可以结合到PKB仅的底物结合位点，对PKB形成抑制，抑制常数KI常数达到12UM23。将转录因子FOXO3的1624号氨基酸序列与之糅合，得到一个KI为11UM的20MET的杂肽。用ALA代替磷酸化位点的SER,抑制活性有了10倍的提高，KI达到11UM。这类抑制剂由于分子过大，使得它们难以作为小分子抑制剂的先导化合物被研究和应用。43PKB别构抑制剂由于PKB三种亚型在结构上存在稍微的差别，特别是在39个氨基酸残基的连接部位的差别，使得PKB、PKB及PKB在功能上也不尽相同，利
12、用这些差别可以选择性的对他们进行抑制。CRAIGWLINDSLEY等人24利用高通量筛选得到对PKB、PKB及PKB都有抑制活性的先导化合物，该化合物显示了较高的异构体选择性，对PKB、PKB及PKB分别为3400NM、23000NM及大子50000NM，而对于同为AGC家族的其它蛋白则无抑制活性对PKA、PKC、SGK的IC50都在50000NM以上。研究发现它对缺少PH结构域的PKB突变体是没有抑制活性的，并且它对PKB的抑制与ATP是非竞争的，揭示它可能是结合于PKB上的别构位点，属于一类PH结构域依赖性的非ATP竞争性抑制剂。44ATP竞争性抑制剂25JONGHEEKO等人，发现1H吲
13、唑4，7二酮类化合物在胞外对PKB有抑制作用。由此他们合成了一系列1H吲唑4，7二酮的衍生物。对5位以不同的芳胺取代，发现以间氟苯胺和对三氟甲基苯胺的活性最好，得到两种化合物。它们对PKB的IC50分别为1189UM和124UM，优于阳性对照物SWU2009IC5025OUM。用KATOIII细胞株、HEPG2细胞株以及PC3细胞株对这两种化合物进行了细胞毒性试验，发现它们都具有较好的细胞毒性。因为他们竞争性的结合于ATP结合口袋，通过对不同ATP浓度下的抑制活性的研究发现，低ATP浓度时，抑制活性高，而高ATP浓度时，抑制活性低，由此判断这两种化合物是一种ATP竞争性的PKB抑制剂。由此，我
14、们发现了很多这样的ATP抑制剂，像3,5二取代吡啶类抑制剂26、3异喹啉吡啶27及其修饰产物，也是我们目前PKB抑制剂的研究方向。45P13KPKB通路抑制剂由于PKB的活化首先要通过PTDLNS3，4，5P3将其募集到胞膜上，再由同样被PTDLNS3，4，5P3募集到胞膜上的PDKL磷酸化。所以设计一类可以抑铜JPDKL活性的化合物，也是可以间接抑制PKB的活性。46机理未知的抑制剂化合物44API21871是一个杂环核苷，在变异细胞中，能够抑制PKBP的磷酸化。它对P13K和PDKL无抑制作用。在许多肿瘤细胞株中，API2诱导凋亡，抑制PKB口过表达的肿瘤的生长。尽管其抑制机理尚不清楚，它
15、已经应用于L期临床并和2期临床的研究，也发现了包括导致高血糖在内的许多副作用。PKB抑制剂的研究方向主要是向分子量小，作用稳定，高效的方向发展，除了天然发现的PKB抑制剂外，也有大量人工合成的PKB抑制剂。现在一般是通过电脑模拟计算和实验的对比，来获得我们期望得到的抑制剂。综上所述，我们从PKB的结构、活化调节、生理功能及其抑制剂的研究进展可以知道，其在介导调节细胞代谢、细胞存活、细胞周期调控、转录调控等多种生物学过程中发挥着重要作用。现在我们努力研究新的抑制剂，通过调控PKB的活性，间接调节其调节的生理通路的进行，从而可以治疗人类一些疾病，如肿瘤、糖尿病等。参考文献1唐波,姜军PKB/AKT
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20、35416ALEMZADEHR,ZHANGJ,TUSHAUSK,ETALDIAZOXIDEENHANEESADIPOSETISSUEPROTEINKINASEBACTIVATIONANDGLUCOSETRANSPORTER4EXPRESSIONINOBESEZUCKERRATSJMEDSCIMONIT2004,103BR536017周巧生联苯取代的1，2，4噁二唑类小分子PKB抑制剂的设计与合成D浙江大学药学院,200815818SUNDQVISTA,BENGOECHEAALONSO,LUKIYANCHUKV,ETALCONTROLOFLIPIDMETABOLISMBYPHOSPHORYLAT
21、IONDEPENDENTDEGRADATIONOFTHESREBPFAMILYOFTRANSCRIPTIONFACTORSBYSCFFBW7JCELLMETAB2005,1637939119JOZWIAKJ,SERGIUSZJOZWIAK,TOMASZGRZELAETA1POSITIVEANDNEGATIVEREGULATIONOFTSC2ACTIVITYANDITSEFFECTSONDOWNSTREAMEFFECTORSOFTHEMTORPATHWAYJNEUROMOLMED2005,7428729620TRAN,H,BRUNET,A,GRIFFITH,ECETALTHEMANYFORKSI
22、NFOXOSROADJSCISTKE2003172,RE521LIANGJ,ZUBOVITZJ,PETROCELLIT,ETALPKB/AKTPHOSPHORYLATESP27,IMPAIRSNUCLEARIMPORTOFP27ANDOPPOSESP27MEDIATEDG1ARRESTETA1JNATKLED2002,8101153116022VIGLIETTOG,MOTTIML,MARIALETIZIAMOTTIETA1REGULATIONOFP27KIP1PROTEINLEVELSCONTRIBUTESTOMITOGENICEFFECTSOFTHERET/PTCKINASEINTHYROI
23、DCARCINOMACELLSJIVATMED,2004,64113823382923LUOY,SMITHRA,GUANR,ETALPSCUDOSUBSTRATEPEPTIDESINLIVERDISEASESDETECTIONANDCANSERVEASAPROGNOSTICDURINGCANCERRHERAPYJBIOCHEMISTRY,2004,4371254126324CRAIGWL,ZHIJIANZ,WILLIAMHL,ETA1BIOMEDICALRESEARCHEDUCATIONTRAININGBIOORGJMEDCHEMLETT2005,151076176425CRAIGW,LIND
24、SLEYTHEAKT/PKBFAMILYOFPROTEINKINASESAREVIEWOFSMALLMOLECULEINHIBITORSANDPROGRESSTOWARDSTARGETVALIDATIONA2009UPDATEJ,CURRTOPMEDCHEM2010,10445847726SHEELAA,KEITHW,XIAOHONGSONG,ETALIDENTICATIONOFANOVEL3,5DISUBSTITUTEDPYRIDINEASAPOTENT,SELECTIVE,ANDORALLYACTIVEINHIBITOROFAKT1KINASEJBIOORGMEDCHEMLETT2006,16143740374427QUNLI,KEITHW,SHEELATHOMAS,ETALSYNTHESISANDSTRUCTUREACTIVITYRELATIONSHIPOF3,4BISPYRIDINYLETHYLENESDISCOVERYOFAPOTENT3ISOQUINOLINYLPYRIDINEINHIBITOROFPROTEINKINASEBPKB/AKTFORTHETREATMENTOCANCERJBIOORGMEDCHEMLETT2006,16720002007
