1、毕业论文文献综述生物工程梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析摘要组织蛋白酶B（CATHEPSINB，CB）为半胱氨酸蛋白酶，具有广谱的蛋白水解活性。本文就CB的生物学特性与生理功能及酶学性质，酶原如何激活，CB与肿瘤扩散和细胞凋亡的关系以介绍，并对CB的抑制剂和应用方面的研究做了总结，最后总结了CB的基因结构特点及其表达调控机制。关键词组织蛋白酶B；细胞凋亡；抑制剂；基因结构；表达调控1组织蛋白酶B简介组织蛋白酶B（CATHEPSINB，CB）为半胱氨酸蛋白酶，在酸性PH的溶酶体中，CB主要是外肽酶，若在中性或碱性PH环境中，CB则为内肽酶（徐昌隆等，2004；李杰平等，2008）。CB的
2、此种水解蛋白的双重活性，使其蛋白水解范围很广。CB存在于细胞质和溶酶体中，其活性中心有巯基，可降解细胞外基质成分，进而破坏组织屏障赵艳艳等，2008。CB广泛存在于细菌、昆虫和哺乳动物中。溶酶体的降解蛋白质过程中，CB发挥着重要的作用，血浆蛋白、激素和细菌等被溶酶体内的蛋白水解酶类水解。CB对多种昆虫，如棉铃虫、蚊等的卵黄磷蛋白水解活性高，提供胚胎发育必要的营养物质（杜欣军等，2004）。2CB酶学性质日本血吸虫CB基因所编码的蛋白分子量395KD，不含有亮氨酸。520位氨基酸区域可能为跨膜结构域，CB信号肽剪切位点在第26和27位氨基酸之间。蛋白序列中含有一个肽酶C1催化结构域，含有半胱胺酸
3、蛋白酶活性位点和磷酸化位点，因此推测此蛋白的活性可能会受磷酸化作用调节。研究海参CB酶学性质发现，CB最适温度为40，最适PH为55（赵露露等，2008）。3CB酶原激活无活性的前体酶原水解后变成成熟的组织蛋白酶，前体酶原由含有成熟酶活性中心的催化域和信号肽前体肽二者构成。信号肽负责将核糖体表达的前体酶原蛋白转运到内质网，然后在内质网被水解形成酶原。酶原通过蛋白水解，变为分子量30KDA的成熟单链形式，再作经进一步的裂解，最后才形成具有活性的成熟组织蛋白酶B。溶酶体内的CB，首先在粗面内质网的核糖体内合成无活性酶原，到胞浆糖基化，糖基在高尔基体中被磷酸化修饰，形成甘露糖一6一磷酸蛋白，溶酶体上
4、的6一磷酸甘露糖受体能对其进行识别，进而胞饮入溶酶体内。CB有两种成熟形式，双链的形式或单链形式杨丽等，2008。4CB与肿瘤和细胞凋亡41CB与肿瘤一方面，研究表明CB与瘤细胞的侵袭和转移相关。EXON2和EXON3以及激活前体蛋白肽的7个氨基酸残基在肿瘤时缺失，形成了特殊的MRNA产物，蛋白质合成后因其缺失信号肽，所以不能沿内质网途径进入溶酶体而弥散于胞浆中，在癌细胞转移的过程中，CB可以直接溶解细胞外基质，产生可降解如层粘素、纤维连接蛋白等成分的酶，进而促进了肿瘤细胞向组织深部的浸润（华静等，2002）。瘤细胞分泌的CB不能被摄人的溶酶体，因其缺乏甘露糖一6一磷酸受体识别标记。利用免疫组
5、化及原位杂交技术研究，发现CB在许多的种肿瘤细胞中表达较高（刘顾等，2008）。另一方面来讲，血管被CB通过多种机制促进形成，进而促使肿瘤生长。CB降解基底膜和细胞外基质时，会从细胞外基质中释放促血管生长因子，促进血管生成。另外，CB还可以降解金属基质蛋白酶的抑制剂，直接或间接促进血管生成（肖庆等，2008；王中显等，2006）。42CB与细胞凋亡促凋亡蛋白BID被CB裂解后，细胞色素C从线粒体被释放，导致细胞凋亡的瀑布效应。这表明组织蛋白酶B与细胞凋亡存在着紧密的关系（李杰平等，2007）。CB基因被剔除了的小鼠，对于TNF介导的肝细胞凋亡和肝损伤有阻断作用。CB还参与了WEHIS纤维肉瘤中
6、TNF介导的细胞凋亡，这也同时说明了CB有截然相反的两个作用既可以促使瘤细胞对周围组织的侵袭；也可以促进瘤细胞凋亡。组织蛋白酶B有两条途径介导细胞凋亡组织蛋白酶B不依赖于CASPASES的细胞凋亡途径；组织蛋白酶B依赖于CASPASES的细胞凋亡途径（李杰平等，2007；王翠芬等，2008）。5CB抑制剂人类的CB的抑制剂均属于内源性的蛋白抑制剂，且专一性较差。恶性肿瘤中CB与CB抑制剂之间生理平衡的破坏，及CB抑制剂的表达下降，造成了CB活性的增加。肿瘤的侵袭和转移过程，有CB同其抑制剂共同作用的参与。CB抑制剂有潜在治疗和控制癌细胞转移的作用，目前CB抑制剂已成为研究抗肿瘤药物的一个重要研
7、究方向（肖庆等，2008）。CB有三类主要的抑制剂一类为KININOGENS，其对CB的抑制作用较弱；第二类为CYSTATINS，主要包括CYSTATINC，CYSTAINC是对CB亲和力最大的蛋白；第三类为STEFINS，包括STEFINC、STEFINA和STEFINB。最近又发现了五种对组织蛋白酶B具有较好抑制活性的黄烷醇类天然化合物抑制剂PROEYANIDINB2，PRODELPHINIDINB23OGALLATE，EPIGALLOCATECHIN30GALLATE，PRODELPHINIDINB2和PUERINA，其IC50值分别为076，058，096，044和207MOL/L。这
8、五种抑制剂是组织蛋白酶B的新型天然的抑制剂（贾锐锐等；2008）。大肠癌患者的CYSTATINC比正常时增加16倍，其抑制剂的含量虽增加，但增加的抑制剂并未平衡相应增加的组织蛋白酶B酶活性，即组织蛋白酶B和其抑制剂处于失平衡状态。因此，可以将组织蛋白酶B的抑制剂与其比值用来作为断定肿瘤恶性程度（乔镇等，2008；刘颐等，1998）。6CB应用研究61CB疫苗日本血吸虫的CBDNA疫苗SI31BIN给小鼠接种后，结果显示日本血吸虫CBDNA疫苗具有高度的抗生殖免疫作用（易新元等，2000）。体外转录合成CB基因的特异性SIRNA并转染EC9706细胞，结果表明不同浓度的SIRNA对CB及MRNA
9、的表达都有抑制效应（娄欣等，2007）。进一步的研究表明，疫苗使小鼠获得了抗血吸虫感染的能力（田明礼等，2001）。因此推测，SJ31B1N免疫后产生了细胞免疫，对血吸虫的产卵和发育具有一定的影响，这给人类的抗寄生虫感染带来了新希望（曾宪忠等，2001）。62CB抑制剂的应用巯基蛋白酶抑制剂在防治病虫害上面，显示了广阔的应用前景。因为CB消化酶活性被抑制剂抑制，会引起昆虫正常代谢的扰乱，甚至导致死亡。当前，已经克隆了水稻、玉米等L5种不同来源蛋白酶抑制剂的CDNA，并转入到不同植物中，其中大部对昆虫有明显抗性。CB抑制剂还有潜在的控制癌细胞转移的作用，已成为研究抗寄生虫感染、抗肿瘤疾病药物的重
10、要研究方向。63CB在食品工业中的应用CB在食品工业中具有重要的应用价值。CB能将肌肉中的蛋白质分解成游离氨基酸和多肽，进而降解成风味成份醛类和酮类化合物。CB能降解原肌蛋白、肌球蛋白等蛋白，在肉加工时的嫩化、成熟中发挥重要作用（赵改名等，2003）。7CB基因结构特点CB基因的核苷酸有一定的保守性，不同种动物及不同组织的CB序列具有相似的结构与组成。日本血吸虫CB基因序列与曼氏血吸虫CB肽链内切酶基因序列高度同源85的同一性，编码348个氨基酸（胡永轩等，2004）。鼠的CB基因由10个外显子EXON和9个内含子INTRON组成，催化活性位点被内含子分开，5端具有TATA盒和信号肽。禽的CB
11、基因共编码340个氨基酸，与鼠的CB序列很相似（DONG等，2004）。8CB基因表达调控机制CB表达的调节，存在着基因、转录和转录后水平，以及翻译、翻译后修饰等多水平的调节（李美宁，2005）。转录因子，如ETS1、CBBP和SP1等均在转录过程中起重要作用。视黄酸、钙化醇等，在转录和转录后水平都起着调控CB表达的作用（ISABELLEMBERQUIN等，1999）。另外，MRNA异常的表达也可以致使CB的外泄，在转录、转录后加工、翻译等过程中，都能影响到CB的活力。反义RNA技术可对蛋白质进行负调控卢士英等，2004。参考文献1徐昌隆,黄智铭,陈民新,等组织蛋白酶B及其基因在肝癌中的表达及
12、意义J温州医学院学报,2004,3464144162李杰平,张平,张书杰,等实验性肺纤维化大鼠肺组织CATHEPSINB表达的动态变化J中国现代医学杂志,2008,18165683赵艳艳,刘建兵,罗梅浩,等烟夜蛾组织蛋白酶B酶原基因的克隆、序列分析和原核表达J昆虫学报,2008,5111112111284杜欣军,邵红莲,邵丁丁,等棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化J农业生物技术学报,2004,1221621665赵露露,董秀萍,于蕾,等海参体壁组织蛋白酶B酶学性质的研究J食品研究与开发,2008,298596杨丽,陈清江宫颈鳞癌组织中组织蛋白酶B、层粘连蛋白表达及其意义J医学论坛杂
13、志,2008,291713157华静,任卫平,陆伦根,等不同亚型胃癌细胞株裸鼠移植瘤中组织蛋白酶B的表达J胃肠病学,2002,731631658刘顾,施尧,王利民,等原位杂交检测胃癌组织中组织蛋白酶B的表达J中华消化杂志报,1998,1881811829肖庆,唐深,樊晓晖组织蛋白酶B及抑制剂与肿瘤J现代肿瘤医学,2008,16467467610王中显,刘少扬,江大琼组织蛋白酶B在卵巢癌中的表达及意义J肿瘤,2006,26655956211李杰平,何平平,于小华,等大鼠肺纤维化细胞凋亡及CATHEPSINB基因变化的关系J现代生物医学进展,2007,5269669812李杰平,张平组织蛋白酶B与
14、细胞凋亡及肺纤维化的关系J国际呼吸杂志,2007,27429529713王翠芬,陈敏,等溶酶体CATHEPSINB参与大黄素诱导HK2细胞凋亡J东南大学学报医学版,2008,27640440814肖庆,唐深,樊晓晖组织蛋白酶B及抑制剂与肿瘤J现代肿瘤医学,2008,467467615贾锐锐,曾广智,等组织蛋白酶B的新型天然抑制剂J云南植物研究2008,30562162316乔镇,关景明,汪丽燕组织蛋白酶B及其抑制剂CYSTATINC与大肠腺瘤及大肠腺癌关系的实验研究J浙江临床医学,2008,10674975017杨正时海鱼弧菌感染J国外医学微生物学分册,1989,82818318易新元,曾宪忠
15、,汪世平,等日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗抗生殖免疫的研究J中国人兽共患病杂志,2000,161454719娄欣,张红,曹学全,等组织蛋白酶B特异性SIRNA对食管癌EC9706细胞组织蛋白酶B基因表达的影响J郑州大学学报医学版,2007,421141720曾宪忠,易新元,曾宪芳日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗血清抗体与抗生殖免疫关系的初步研究J中国人兽共患病杂志,2001,174404221田明礼,易新元,曾宪芳,等日本血吸虫31KDA组织蛋白酶BDNA疫苗保护性免疫效果观察J中国血吸虫病防治杂志,2001,13420921222赵改名,周光宏,徐幸莲肌肉内源蛋白酶及其在干腌火腿加工过程中的
16、作用J食品与发酵工业,2003,294707423胡永轩,肖建华,曾桥,等日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶基因的获得及结构与功能分析J中国人兽共患病杂志,2004,20979079324DONGSS,STRANSKYGI,WHITAKERCH,ELA1AVIANCATHEPSINBCDNASEQUENCEANDDEMONSTRATIONTHATMRNASOFTWOSIZESAREPRODUCEDINCELLTYPESPRODUCINGLARGEQUANTITIESOFTHEENZYMEJBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA1995,125L697325李美宁组织蛋白酶B与肿瘤J国外医学肿瘤学分册,2005,32642943226BERQUINIM,YANS,KATIYARK,ELA1DIFFERENTIATINGAGENTSREGULATECATHEPSINBGENEEXPRESSIONINHL60CELJJLEUKOCBIOL,L999,66460961627卢士英,任洪林,柳增善,等组织蛋白酶B研究进展J河北师范大学学报自然科学版,2004,283306309
