1、毕业论文文献综述食品科学与工程乳酸菌高密度培养技术的研究现状摘要高密度培养技术一般指在液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术，达到提高菌体发酵密度的目的。本文重点介绍了影响乳酸菌高密度培养的因素及高密度培养原理、方法，并对高密度培养的前景进行了展望。关键字乳酸菌；高密度；影响因素；培养方法。ABSTRACTTHEHIGHDENSITYCULTURETECHNOLOGYGENERALLYREFERSTOTHESTATEOFGROWTHORCULTURETECHNIQUEOFDENSITYOFMORETHAN10TIMESMORETHANCONVENTIONALCULTUR
2、E，WHICHIMPROVESTHECELLDENSITYFERMENTATIONTHISPAPERFOCUSESONFACTORSTOAFFECTHIGHDENSITYCULTUREANDHIGHDENSITYCULTUREPRINCIPLE、METHODS,ANDHIGHDENSITYCULTIVATIONPROSPECTKEYWORDSLACTOBACILLUSHIGHDENSITYINFLUENTIALFACTORCULTUREMETHOD乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰染色阳性细菌的总称。乳酸菌在肠道内的大量繁衍可促进并提高人体的全身免疫能力，研究认为酸牛奶中含大量
3、乳酸菌与常饮酸牛奶的人极少患糖尿病、心血管病、肥胖症有关。在我国，伴随着人民生活水平的提高，对酸奶的消费呈现出逐年增加的势头，这也就对酸奶发酵剂的性能和品质提出了新的要求。1乳酸菌高密度培养的意义乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品，赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群，而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用，也是传统食品的发展方向1,2。浓缩发酵剂1,3,4具有活力高、体积小、携带使用方便的特点，可直接用于发酵制品生产，省去扩大培养的复杂操作过程，从而简化产品生产工艺，有利于保持产品质量的稳定
4、，防止菌种的退化和污染。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养1，4。高密度培养技术HIGHCELLDENSITYCULTURE,HCDC，即高密度发酵技术，一般指在液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术，达到提高菌体发酵密度的目的5。高密度培养不仅可减少培养体积，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品市场竞争力4。2影响乳酸菌高密度培养的因素影响高密度培养的因素非常多，如菌体生长所需的营养物质、培养过程中生长抑制物的积累、溶解氧浓度、培养温度、培养液的PH值、补料方式及培养液流变学特性等67。然而高密度培养的工艺是比
5、较复杂的，仅仅对营养源、溶氧浓度、PH值、温度、接种量等影响高密度培养的因素单独地加以考虑是远远不够的，因各种因素之间存在协同和（或）抵消作用，需加以综合考虑并对培养条件进行全面的优化。乳酸菌培养过程中生长不仅与培养方式有关，也与所用培养基有直接关系。限制细菌高密度培养的主要因素包括培养基组成、培养温度、PH值及代谢产物或副产物的积累等8。21培养基9培养基为微生物的生长繁殖和积累代谢产物提供营养基质。在进行浓缩培养时，培养基除了要提供微生物生长所必需的碳源、氮源、生长因子等物质外，必须对培养基进行优化，筛选出增殖培养基，以求能获得最大的生物量。筛选时通常要在培养基（如MRS培养基等）的基础上
6、再添加碳源、氮源、生长因子等，最后通过测定菌体数来确定增殖培养基的成分。常添加的碳源有乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及复合糖葡萄糖等，添加的氮源有普通蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钠等，常添加的生长因子有番茄汁、玉米浆等，最后通过正交试验来确定添加的物质和量。22温度9温度是控制微生物代谢的重要参数。在一定范围内随着温度的上升，酶的活性会提高，细胞的生物化学反映速度和生长速率会加快，同时营养物质和代谢产物的溶解度提高，细胞膜的流动性增大，有利于营养物质的吸收和代谢产物的排出。每种微生物都有不同的最适生长温度，同种微生物在不同的培养基中生长的最适温度也有差别。因此在其他条件一定的情况下，选择
7、一个适宜的培养温度，对于浓缩培养有重要意义。乳酸菌的最适生长温度一般随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段变化而改变，不同的乳酸菌最适生长的温度范围会有一定的差异。乳酸菌的最适生长温度一般在374210。23PH值11乳酸菌生长的最适PH值为6570，乳酸菌细胞在生长过程中产生大量有机酸，酸积累到一定程度就会抑制细胞的生长。因此，提高培养基的缓冲能力，控制培养基PH值的变化幅度，对细胞的积累有较大的调节作用。PH值的变化是菌体产酸或产碱等生化代谢反应的综合结果，也是确定补料速率的依据，把两者紧密结合起来可实现高密度培养发酵过程的优化。在自动流加新鲜培养基的高密度培养模式中，通过不断补料的
8、方法，可成功调节PH值使菌体达到高密度。24代谢产物11代谢产物的调控是研究高密度培养的一种重要手段。依据对生长曲线的分析，导致微生物停止生长的主要原因之一是代谢产物的积累和反馈抑制作用。高密度培养过程中，乳酸菌细胞在电子传递链和三羧酸循环代谢中都会产生乳酸及其它代谢产物。其中对菌体生长影响最大的就是乳酸。当分批培养中的细胞密度超过一定浓度时，菌体生长会变得缓慢甚至停止。这是由于发酵过程中乳酸盐等盐类对细菌的生长产生了负面影响，抑制了蛋白质合成代谢副产物的积累。目前，国外已有研究希望通过代谢工程改变乳酸菌的代谢途径，从而降低抑制产物的生成。3高密度培养的原理从理论上来讲，只要营养物充足、无生长
9、抑制物积累，微生物的生长在空间上不受限制时微生物将持续生长，即导致微生物生长减速或停止的原因是营养物的枯竭或生长抑制物的积累10。若能克服这两方面的影响，就可以获得较高的菌体密度。在乳酸菌的高密度培养过程当中，主要的限制因素就是代谢产物的影响。在乳酸菌的培养过程中，乳酸菌通过发酵作用对碳源进行分解代谢产生乳酸，其代谢途径分为三类，即同型发酵途径，异型发酵途径和双歧途径。以碳源为葡萄糖为例，1MOL葡萄糖在同型发酵中产生18MOL的乳酸，异型发酵产生08MOL乳酸。乳酸菌对其他糖类（乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖和戊糖等）发酵也主要产生乳酸12。在发酵过程中一般以同型发酵为主，大约有8
10、0的糖会转化成乳酸，大量的乳酸对发酵液的PH又会产较大的影响，当培养液的PH值降低到40以下时，就会对菌体的生长产生较严重的抑制作用。因此，在乳酸菌的浓缩培养过程中，就必须通过追加营养物质，排除代谢产物，调节PH值来解除代谢产物乳酸对菌体生长的抑制作用，获得高浓度的菌体培养物。4高密度培养方法乳酸菌在培养过程中能分解培养基中的糖类而产生以乳酸为主的有机酸。由于代谢产物的积累会抑制菌体生长，采用常规方法培养时，其培养液中的活菌数只能达到107108CFU/ML13。实现微生物（益生菌）菌体高密度培养的核心是保证合理的营养供给、及时去除代谢产物、保持稳定的比生长速率。高密度培养的主要途径有缓冲盐法
11、、化学中和法、透析培养、细胞循环培养、膜过滤培养、补料分批培养、微囊化培养等。41缓冲盐法缓冲盐法是向乳酸菌的培养液中加入对乳酸菌的生长无影响或者有促进作用的缓冲盐，以调节和控制培养液的酸度在一定范围内不升高，促进乳酸菌的生长繁殖。通常所选用的缓冲盐有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和CACO3等，也有研究者直接利用乳本身蛋白质和磷酸盐。美国和意大利已成功研究了向培养基中添加缓冲盐的专利方法。国内学者对此亦有研究，刘云鹤等添加一定量的缓冲剂对发酵乳杆菌和植物乳杆菌细胞的积累有显著的促进作用，3种缓冲盐中，磷酸氢二钾的促进作用最为明显，柠檬酸三铵次之，乙酸钠最弱14。吕兵等15使用质量分数为05的K2H
12、PO4作为缓冲盐进行培养，使培养液中乳酸菌的活菌数达到589109CFUML，较起始培养基的活菌数提高了45倍。目前，研究较多的是缓冲盐法，浓缩培养的效果也比较明显。然而由于缓冲盐的缓冲作用有一定的范围，因此菌液不能达到较高的菌体浓度，另外高盐浓度也会对菌体的生长产生抑制作用。42化学中和法乳酸菌在生长繁殖过程中，代谢乳糖产生乳酸。随着酸度的升高，PH值的降低，菌体生长受到抑制，通过向发酵液中流加碱液从而将发酵过程当中产生的过量乳酸中和，解除PH值的抑制，维持发酵液的PH值在一个恒定的范围内，以促进乳酸菌的生长。由于化学中和法极大地促进了乳酸菌的生长，并且该法简便易行，最终获得高密度的菌体，因
13、此是目前应用最广泛的一种方法。常用的中和剂有NAOH、氨水、NA2CO3等。其中氨水的效果最好，但在中和培养过程中，随着乳酸铵或乳酸钠等盐浓度的不断增加，达到一定水平时仍会抑制菌体的生长繁殖，最高密度仅能到1091010个/ML16。吕兵等人利用质量分数为30的NA2CO3溶液作为中和剂进行浓缩培养，将PH值控制在63，培养67H后，乳酸菌浓度达到589109CFU/ML17。43透析培养通过半透膜有效地去除培养基中有害的低分子量代谢产物，同时向培养液提供充足的营养物质的培养方式称为透析培养。OSBORNE在1977年首次将透析用于乳酸杆菌培养，得了1011个/ML的高菌体密度，相当于3040
14、G（DCW/L）18。透析培养仪器一般有培养罐、培养基储存罐和透析模块三部分组成。透析模块主要有两个作用，一是将生长抑制物质通过透析模块排出培养罐，二是使营养物质从培养基储存罐中的营养物质进入培养罐中19。透析培养主要发展了营养分配补料策略，即将培养基分为浓缩营养液和无机盐溶液2部分，浓缩营养液直接加到培养室，无机盐溶液则加到透析室以维持渗透压。采用这种培养方式，可以增加生物量的积累，大大降低营养物质的损失。与微滤和超滤相比，在透析过程中透析膜不会被阻塞，并且可以长时间维持其渗透性能20。但是，由于反应器本身需要内嵌的透析膜或外在的透析组件、辅助泵及其它发酵罐等，透析培养的设备投资较大。44细
15、胞循环培养通过某种方式将细胞保留在培养罐中加以循环利用的培养方式就是细胞循环培养。一般通过沉降、离心和膜过滤3种方式进行2122。膜过滤培养是连续培养和超滤的结合。它是在普通培养装置上附加一套膜过滤系统，用泵使培养液流过过滤器，将菌体截留，滤液流出培养体系，并通过液面计控制流加泵添加新鲜的培养基，维持培养基体积不变。细胞循环可以除去抑制性代谢产物，低浓度的培养基可以得到较高的细胞密度并且可以就地分离产物，有利于下游操作。45膜过滤培养膜过滤培养是连续培养和超滤的结合，它是在普通培养装置上附加一套膜过滤装置。用泵使培养液流过过滤器将菌体截留，滤液包括培养过程中的产物一起流出培养体系，并通过液面计
16、控制流加泵添加新鲜的培养基，维持培养基体积不变。膜过滤培养过程中乳酸被完全去除，是目前效果最好的浓缩培养方法。CHIARA曾经使用膜过滤培养法对保加利亚乳杆菌进行培养，获得的细胞干质量达到280G/L23。46补料分批培养补料分批发酵在微生物高密度培养中应用较多，特别是应用在重组大肠杆菌的高密度培养中技术已相当成熟24。在补料分批培养过程中，高密度发酵成功的关键是补料策略的选择。它是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段以某种方式间歇地或连续地补加新鲜培养基，使菌体及其代谢产物的生产时间延长的培养方式。因此，补料分批培养（又称流加培养）比其它培养方法具有更多的优越性。贺稚非等6综
17、合运用缓冲盐法及补料培养法，使培养液中乳酸菌的活菌数达到724109CFU/ML。47乳酸菌微囊化培养乳酸菌液芯微囊化培养是固定化技术中的一种，它是用一层亲水性半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，通过连续培养，在囊内可以达到很高的细胞密度。传统的乳酸菌培养采用游离细胞悬浮培养，生产效率低，细胞密度低，细胞分离难，成本高。微囊化乳酸菌避免了传统悬浮发酵剂的缺点和限制，细胞密度可超过1010个/G，从培养基中分离细胞不需经过超滤或冷冻离心，而用普通的离心或过滤就可进行，因此大大降低了生产成本。另外，微囊化细胞技术可以防止氧对双歧杆菌等好氧菌的伤害，防止噬菌体的感染，在冷冻过程中有很好的保护作用，用于浓
18、缩乳酸菌生产效果比较显著。周剑忠等人对液芯包囊乳酸菌（嗜热链球菌保加利亚乳杆菌11）进行了壳聚糖包膜，在MRS中连续培养40H，囊内细胞密度已高达661010个/G25。5乳酸菌高密度培养前景及展望目前，我国超浓缩酸奶发酵剂的制备技术还不完善，商业化超浓缩酸奶发酵剂国内还没有厂家生产，作为发酵剂制备的核心技术，乳酸菌高密度培养的研究及应用势在必行。随着市场需求的日益扩大，乳酸菌高密度培养技术必将广泛地应用于乳酸菌发酵剂的生产中。如此，不仅能改进乳酸菌发酵的工艺，提升其现代化发酵进程，而且对增加单位体积培养液中的菌体数量，提高生产效率，加速乳酸菌发酵剂的商品化进程，更好地满足市场需求，均具有重要
19、而深远的意义26,27。可以预见，乳酸菌高密度培养技术的市场前景十分广阔。参考文献1EGONBECHHANSENCOMMERCIALBACTERIALSTARTERCULTURESFORFERMENTEDFOODSOFTHEFUTUREJINTJFOODMICROBIO,2002,781191312刘振民,骆承庠乳酸菌发酵剂生产工程技术J食品与发酵工业,2000,26468723山丽杰,田洪涛,贾英民等浓缩型乳酸菌发酵剂制备中几个技术关键问题的探讨J中国乳品工业,2002,30566694RIESENBERGD,GUTHKERHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFMICROO
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22、18OSBORNERJWPRODUCTIONOFFROZNECONCETRATEDCHEESESTARTERSBYDIFUSIONCULTURESOCDAIRYTECHNOL,197730404419OGBONNAJC,MARKLHNUTRIENTSPLITFEEDINGSYRATEGYFORDIALYSISCULTIVATIONOFECOILBIOTIECHNOLBLOENG,1993,41109220PROTNERRMARKLHDIALYSISCULTURESAPPLMICROBIALBIOTECHNOL19985040341421KANGBC,LEESY,CHANGHNPRODUCTIO
23、NOFBACILLUSTHURINGIENSISSPOREINTOTALCELLRETENTIONCULTUREANDTWOSTAGECONTINOUSCULTRUREUSINGANINTERNALCERAMICFILTERSYSTEMBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,1993421107111222PARKBG,LEEWG,CHANGY,ETALLONGTERMOPERATIONOFCONTINUOUSHIGHCELLDENSITYCULTUREOFSACCHAROMYCESCERAVISIAEWITHMEMBRANEFILTRATIONANDONLINECELL
24、CONCENTRATIONMONITORINGBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,1999219710023CHIARAS,VINCENZO,VIVIEN,ETALHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFPROBIOTICSANDLACTICACIDPRODUCTIONBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,2002,82221322224陈坚,李寅,毛英鹰等培养模式对重组大肠杆菌高密度培养生产谷胱甘肽的影响J生物工程学报,1998,14445245525周剑忠,董明盛,江汉湖等液芯包囊乳酸菌细胞释放及浓缩培养的初步研究J食品工业
25、科技,2004,255707226ULRICHKULOZIKANDJURGENWILDERAPIDLACTICACIDPRODUCTIONATHIGHCELLCONCENTRATIONSINWHEYULTRAFILTRATEBYLACTOBACILLUSHELVETICUSBIOTECHOL1999,2136540327AOLMOSDICHARA,FAMPE,JLURIBELARREA,APAREILLEUXANDGGOMAGROWTHANDLACTICACIDPRODUCTIONBYLACTOBACILLUSCASEISSPRHAMNOSUSINBATCHANDMEMBRANEBIOREACTORINUENCEOFYEASTEXTRACTANDTRYPTONEENRICHMENTBIOTIECHNOLBLOENG,1999,3610571065
