1、朊病毒及其检测,小组成员：石勇军 费 鹏 闫 凯 王培培 严 姗 辛儒岱关亚飞 崔金红,CONTENTS,五、朊病毒的检测,1,引言,传染性海绵状脑病(transmissible spongi-form encephalopathy, TSE)是一类致死性的神经系统退行性疾病。在哺乳动物中常见疯牛病、羊瘙痒症、猫海绵状脑病以及传染性水貂脑软化病等；在人身上则发现了库鲁病、致死性家族失眠症、克-雅氏病以及格斯特曼综合症等。患病的人和动物，大脑皮层的神经元细胞会发生进行性空泡化, 星形胶质细胞不断增生, 造成灰质变薄而白质相对明显,最后变成海绵状态。,（左）病羊神经组织的海绵状损伤。（右）病人大脑
2、组织切片，海绵状病变及周围的沉淀斑,2,朊病毒的发现,3,朊病毒引起的人类疾病,4,朊病毒引起的人类疾病,5,疾病来源,6,致病特点,PrPc PrPSc,螺旋,折叠,二者是异构体,由同一染色体基因PRNP编码，其氨基酸序列完全一致,根本差别在于它们构象上的差异，PrPC分子中含42%的螺旋，折叠仅为3 %，而PrPSC的折叠高达43 %，螺旋为30 %。故一般认为，PrPSC是由于PrPC发生蛋白质错误折叠，一些螺旋变构为折叠，三维构象发生变化而产生的，同时带来一系列理化性质的变化。,4,PrPC向PrPSC的转化,（PrPSc的累积）,（PrP转化为PrPSc),(PrP与PrPSc之间反
3、应),（PrPc内生）,模型一 ：该模型是假定一个单一的PrPSC分子与一个单一的PrPC分子结合并催化其转化成PrPSC。这两个PrPSC分子,可以继续转换成PrPC。,(伸长),（构象变化),(破碎成多个部分),（感染）,模型二：假设PrPSC只是纤维，捆绑PrPC fibril，然后将其转化成PrPSC，形成更长的纤维，这一现象可在染病毒致病中观察到。,PrPC的功能,1,维持神经系统功能,在所有细胞类型中,以神经元表达PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突触处(终板处也有富集)，这提示PrPC对神经系统有特殊的重要性。PrPC除实验表明，PrPC缺失虽不引起肉眼可见的行为和发育障碍，
4、但在整体动物水平来看可导致与昼夜节律有关的行为异常。在神经系统水平，PrPC缺失可导致电生理参数方面的改变。,有证据表明，在出现进行性运动失调症状PrPC缺失小鼠中，发现脑部严重萎缩，蒲肯野细胞异常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野细胞过度兴奋而导致小鼠死亡。PrPC缺陷鼠还表现出对外源性铜和过氧化氢等应激诱导剂应答方面的改变。在细胞水平，PrPC缺陷鼠的神经元在培养时存活能力下降，且对铜和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所导致的氧化损伤和毒性的敏感性增加；星形胶质细胞在摄取谷氨酸方面有异常；小胶质细胞对兴奋物质的反应性下降；在突触形成中有结构改变。由此可见，PrPC可能在一定程度上参与神经系统功能的维
5、持。,2,参与神经组织的Cu2+代谢,PrPC作为脑组织中膜在铜结合蛋自参与神经组织中Cu2+的稳态平衡调节，当转变为PrPSC就失去结合Cu2+的能力，造成神经组织中Cu2+含量异常，导致神经细胞损伤。 Cu2+对不同神经细胞PrPC的影响也不相同。,3,抗氧化,PrPC通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性。PrPC借其八肽重复区最多可结合4个铜原子。结合后形成的复合物具有抗氧化活性，从而保护细胞免受氧化损伤。,4,参与淋巴细胞信号转导,PrPC可高水平地在人T、B淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞中表达，不同细胞中表达PrPC的糖基组成、糖链形状及蛋自酶解的敏感性都有差异。 T细胞的活化伴随
6、着其表而PrPC的表达上调，且PrPC在记忆T细胞比初始T细胞的表达水平高。,5,细胞凋亡,在PrP敲除小鼠神经元中，多种凋亡相关蛋自显著增加，线粒体Ca2+含量改变、细胞色素c释放，都表明PrP参与细胞凋亡调控过程。 体外试验也显示PrPC能够保护人的神经元免受Bax诱导的细胞凋亡，而缺失八肽序列或C端带有突变的PrP均不具有该活性。,6,核酸代谢,Gabus等根据小鼠中瘟痒病的感染过程会因鼠自血病病毒（MuLV）的复制而加速，以及人类PrP功能上类似于NCp7，可辅助反转录酶合成前病毒DNA等现象，提出PrP可能参与了体内核酸代谢过程。,致病机理,1,阮病毒学说,PrPC是一种膜蛋白，其C
7、端含有23个氨基酸组糖基磷酸肌醇(GPI)锚受体结合位点，因此可通过糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol phosphohptds)联在膜上，定位于细胞膜的穴样内陷类结构域（CLDs），在神经元，当膜浆膜上的PrPC变成为PrPSC后，PrPSC脱落并聚集在神经元的溶酶体。当达到数量，就可使神经元细胞破裂，形成神经组织的空泡化，并使星型胶质细胞增生，,2,“yeast prions”学说,3,蛋白的氧化反应学说,杨池明提出了疯牛病蛋白长寿命自由基即为疯牛病中的亚病毒的理论设想，他认为真正的疯牛病蛋白亚病毒可能是由蛋白的氧化反应所形成的疯牛病蛋白自由基。 应用此理论能够解释疯牛病的一些病理现
8、象。,朊病毒的检测,取组织标本,10个稀释浓度,直到死亡或盲传几代,饲养24h,补接,1,动物的接种传递实验,取标本,1. 前处理,2. 检测,NC：硝酸纤维素膜,前处理品,免疫学检测,取出NC膜,5-7m薄片,收集在NC上,2mm厚切片,切片,55水浴,2,组织印记法,匀浆,离心,处理,显色,最后酶标仪读板,将脑组织置于8%的Zwittergent 3-12和0.5%十二烷基肌氨酸钠中,加入特异性一抗加入酶标二抗最后加入底物,用胶原酶、DNase I（脱氧核糖核酸酶I），蛋白酶K处理,收集富含PrPsc沉淀，将所得沉淀溶于3-4mol/L硫氰酸胍，包被酶标版,3,酶联免疫吸附法,人工合成的P
9、rPsc特异性肽链标记荧光,一定量的特异性抗体、羊脑提取物,标记的肽链与抗体结合后，迁移率发生改变,未与抗体结合的肽链，迁移率不变,当脑提取物中存在微量的PrPsc时,当脑提取物中不存在微量的PrPsc时,电泳,4,毛细管凝胶电泳免疫测定法,如何对非结晶型的朊病毒蛋白进行分子结构的准确分析，能否寻找一种方法，可以获得朊病毒蛋白的准确的高级结构。,朊病毒的致病原因是PrPsc的过度增殖还是由于PrPc正常功能的缺失。,体外试验产生PrPSC到底有无感染性，PrPSC的增殖是否需要其他辅助因子（如RNA）的参与。,科学家已经做了大量的关于朊病毒的研究工作，在许多方面取得了重要的进展，诸如PrPC与PrPSC的结构、PrPC到PrPSC的转化、PrPSC的增殖过程。但尚有许多难题有待我们去解决：,1,
