1、毕业论文文献综述生物工程藻毒素分析处理方法摘要过去几十年间蓝藻水华随着营养元素的增加而频发，引发了严重的环境问题，尤其对饮用水形成了很大的威胁。微囊藻毒素是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞死亡后释放出来并表现出毒性藻毒素能抑制蛋白磷酸酶的活性，对生物体既能表现出急性毒性，也存在慢性毒性，经成为各国水专家广泛关注的问题。文章查阅了大量文献，详细介绍了水体中藻毒素的来源、特性及其危害，在对藻毒素的性质和分析方法进行了分析的基础上，总结了国内外一些先进的去除微囊藻毒素的技术。关键词藻毒素；分析方法；处理方法；1微囊藻毒素的来源、结构和特性11微囊藻毒素的背景及来源近年来，一些作为饮用水源的湖泊、水库
2、等水体富营养化及蓝藻水华爆发已严重威胁到人民群众的饮用水安全1。蓝藻水华爆发不仅造成水质下降，而且还释放出内源性藻毒素，其中微囊藻毒素MC是出现频率最高，危害最严重的藻类毒素2，微囊藻毒素LRMCLR是我国富营养化水体中毒性较大的常见亚型，能强烈抑制蛋白磷酸酶1PP1和蛋白磷酸酶2APP2A的活性3，具有肝脏毒性和肿瘤促进作用4。除了微囊藻（MICROCYSTIS外，蓝藻门中的鱼腥藻属ANABAENA、浮丝藻属PLANKTOTHRIX、束丝藻属APHANIZOMENON中的某些种类也能产生此类毒素。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7个月内至少50人死于藻毒素产生的急性效应，引起举
3、世瞩目的关注。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中毒事件。MC的产生受微囊藻的生长期、光照、温度和营养条件的影响5，生长条件改变，毒性也发生变化，环境因子可以通过作用于细胞分裂速度而控制毒素产生6。12微囊藻毒素的结构MC是一类环状七肽化合物（如图1），其中，环肽结构中含有X和Y两个可变的氨基酸基团。X和Y的不同氨基酸组合可以形成相应的MC异构体，如在LR型中，X和Y分别代表亮氨酸和精氨酸，此外，还有RR、YR等其他多种类型藻毒素。迄今，从野外或实验室培养微囊藻中已分离出近70种毒素异构体7。在已知的MC的异构体中，以MCLR的生理毒性最强是目前已知毒性仅次于
4、二噁英的剧毒化合物。MC结构中所含共轭二烯型氨基酸，ADDA3氨基9甲氧基2,6,8三甲基10苯基4,6二烯酸是表达该类毒素生理活性的最主要特征结构，分别通过形成1,2两个肽键与其他氨基酸缩合成环。除MC外，还有一类名为节球藻毒素NODULARIN的环状五肽也具有ADDA结构。13微囊藻毒素的特性MC和NODULARIN两类肝毒素主要通过生物体的胆汁酸传输系统在生物体内运输并在肝脏、肾脏及消化道组织中累积，然后通过共价键与蛋白磷酸酶结合。这种结合将直接抑制蛋白磷酸酶1和2A的活性，阻断蛋白磷酸化过程，最终导致肝脏等器官的纤维化，促发肿瘤形成。研究表明，当MC特征结构ADDA结合不等数量的氨基酸
5、形成不同长度的肽键后，就会对蛋白磷酸酶1和2A表现出不同程度的抑制作用，即不同的毒性效应8，引发乳动物肝细胞微丝分裂、破裂和出血，肝充血肿大，失血休克死亡等病症9。即使ADDA只和一个氨基酸结合形成肽键后，也会对蛋白磷酸酶起到一定的抑制作用。但未形成肽键的ADDA经生物检测，未表现出明显毒性效应。因此，ADDA结构对这两类肝毒素的毒性行为起到至关重要的作用。MC也能导致细胞的代谢紊乱，释放出大量炎性物质和细胞因子，引起机体的损伤10。2微囊藻毒素分析方法21生物分析方法（1）采用MC毒素合成酶基因MCY基因，鉴定筛选产藻毒素藻株。该法检测下限低，灵敏度高，方便快捷，可检测干藻粉、实验室培养物、
6、无前处理的自然水样等，但不能定量和无法检测溶解的MC11。（2）采用对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性，根据其急性毒性初步筛选，粗略地判断提取物是否有毒性，然后根据毒素作用特点区分神经毒性或肝毒性，并粗略判断毒素含量，但不能鉴定藻毒素结构，该方法操作简便，可快速直观获取结果，但样品需要量大，无法精确定量。22化学分析方法化学分析法对藻毒素可进行精确的定性、定量检测，包括高效液相色谱法HPLC12、二极管阵列检测器DAD13电化学检测器联用、色谱/质谱联用法LC/MS、质谱HPLCMS、毛细管电泳CEMS、高效毛细管电泳HPCE14、气相色谱和质谱GCPMS联用及薄层色谱法TLC等。在化
7、学检测方法中使用较多的是HPLC，HPLC一般用恒溶剂作为流动相，分离柱为ODS反相柱，可以分离包括MCLR、RR、YR和其他藻毒素15，利用梯度洗脱可以分离更多的MC，然后进行紫外UV、荧光FL、化学发光CL或二极管阵列紫外检测器检测，可广泛用于MC的鉴定和定量检测。将被测毒素与标准毒素的滞留时间进行比较可对被测毒素进行鉴定，将两者的峰面积进行比较可对其进行精确定量。HPLC方法技术含量高，价格昂贵；还必须备有标准纯毒素或者某毒素在相同实验条件下的保留值。张昱等16通过固相萃取SPE富集微囊藻毒素MC，并采用液相色谱电喷雾电离质谱，HPLC/ESIMS测定水源水中的MCRR、YR和LR。固相
8、萃取回收率在85以上，固相萃取HPLCMS法的线性检测限为05500NG/L。STUARTAOEHRLE等用改进的超高效液相色谱（UPLC）串联质谱测定方法，在八分钟内迅速而清晰的分析出了有特异性和高峰值的每一种实验藻毒素。本课题使用高效液相色谱三重四级杆质谱分析系统（HPLCQQQMS），对藻毒素研究分析，该方法灵敏、准确，方法检测限达到003NG/ML，能够满足国内外的限量要求，相对于紫外，荧光等等方法更能精确定量分析。23生物化学分析方法主要包括酶联分析法ELISA17、蛋白磷酸酶抑制分析法PPIA18、免疫检测法等，此类方法因其快速、灵敏及工作原理简单易行得以迅速发展，适合分析处理大批
9、样品，但不能对毒素起到良好的鉴别作用，会出现假阳性反应。目前由于微囊藻毒素单克隆抗体难以获得而又受到一定的限制19。3微囊藻毒素处理方法传统的水处理工艺中，混凝、沉淀过程由于管道内部湍流和滤池内压力梯度的作用可能破坏藻类细胞壁，造成藻毒素的释放20，所以传统的水处理工艺会加重藻毒素的危害。31物理法311絮凝沉淀法絮凝沉淀法是一种比较有效的去处水体中藻毒素的方法。戎文磊研究表明经生物砂滤和加氯氧化后能有效降解水中溶解性藻毒素含量，去除率平均达63左右21。GRUTZMACHER等22研究表明慢滤技术也能有效去除饮用水中细胞内毒素。312吸附法活性炭吸附是目前研究最多的一种物理去除微囊藻毒素的方
10、法，常用的活性炭滤料为粉末活性炭PAC和颗粒活性炭GAC。多数研究表明，PAC和GAC均可有效而快速（接触时间30MIN地去除水中的藻毒素。313膜虑超滤、反渗透和钠滤对藻毒素处理有良好的效果。超滤对藻毒素的去除效果可达98，反渗透能达到996，钠滤膜可完全截留水中的藻毒素23。32化学方法溶解在水中的微囊藻毒素表现出极为稳定的特性，能够在高于300高温的条件下不被破坏。但是，微囊藻毒素在色素或者腐殖质物质存在的环境下，可以被光降解24。此外，臭氧氧化也能高效快速地除去藻毒素25。33生物方法天然水体中存在有效降解微囊藻毒素的微生物，它们可以通过改变侧链活性氨基酸基团ADDA的结构或打开环状结
11、构降低其毒性，但过程比较缓慢26。4结语水体富营养化已经成为我国湖泊污染的最主要的问题，藻毒素的存在更给人们的生活环境带来了很大的威胁，我国近年来虽然对藻类的研究已经取得了很大的进步，但是分析及检测方法还有很多不完善的地方，对毒作用机制方面的认识也不是很清楚，处理方法有很多局限性，今后应对MC引起的污染状况给予足够的重视，作出相应的对策。参考文献1VANAPELDOORNME,VANEGMONDHP,SPEIJERSGJA,ETALTOXINSOFCYANOBACTERIAJMOLECULARNUTRITIONANDFOODRESEARCH,2007,5117602PALUSJ,DZIUBAL
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13、IFICINHIBITOROFPROTEINPHOSPHATASE1AND2AFROMBOTHMAMMALSANDHIGHERPLANTSJFEBSLETTERS,1990,26421871924FALCONERIRTUMORPROMOTIONANDLIVERINJURYCAUSEDBYORALCONSUMPTIONOFCYANOBACTERIAJENVIRONMENTALTOXICOLOGYANDWATERQUALITY,1991,621771845DTILLETT,EDITTMANN,MERHARD,ETALSTRUCTURALORGANIZATIONOFMICROCYSTINBIOSYN
14、THESISINMICROCYSTISAERUGINOSAPCC7806ANINTEGRATEDPEPTIDEPOLYKETIDESYNTHETASESYSTEMJCHEMISTRYTWOOFTHEMAJORSERINE/THREONINEPROTEINPHOSPHATASESINVOLVEDINCELLULARREGULATIONCURROPININSTRUCBIOL,1993,39349439肖兴富,李文奇,刘娜，等富营养化水体中蓝藻毒素的危害及其控制J中国水利水电科学研究院学报,2005,3211612310黄湫淇,詹平微囊藻毒素的细胞毒性及机制研究状况J预防医学情报杂志,2005,21
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17、ETECTIONOFVARIOUSFRESHWATERCYANOBACTERIALTOXINSUSINGULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYJTOXICON,2010,555,96597218ANJ,CARMICHAELWWUSEOFACOLORIMETRICPROTEINPHOSPHATASEINHIBITIONASSAYANDENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYFORTHESTUDYOFMICROCYSTINSANDNODULARINSJTOXICON,1994,321214951507
18、19TUBAROA,FLORIOC,LUXICHE,ETALSUITABILITYOFTHEMTTBASEDCYTOTOXICITYASSAYTODETECTOKADAICACIDCONTAMINATIONOFMUSSELSJTOXICON,1996,34974320DRIKASM,CHOWCWK,HOUSEJ,ETALUSINGCOAGULATION,FLOCCULATION,ANDSETTLINGTOREMOVETOXICCYANOBACTERIAJJAMWATERWORKSASSOC,2001,210011121戎文磊,周圣东水厂常规处理工艺去除藻毒素的研究J净水技术,2004,231L
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