1、毕业论文开题报告海洋生物资源与环境假微型海链藻DGAT基因CDNA全长序列的分子克隆和分析一、选题的背景与意义1微藻制备生物柴油11生物柴油近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注逐渐成为热点。生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的单烷基脂肪酸酯。生物柴油作为化石燃料的替代品，与化石柴油和燃料乙醇等其他液体燃料相比，有着突出的特性生物柴油不含石蜡，闪点高，燃烧性能和效率要高于普通柴油，使用时更安全；可以通过种植、养殖或培养源源不断地得到，因而属于可再生资源；生物柴油产品中
2、含硫和氮较少，可以减少产生SO2和NO对大气的排放量。以淀粉类作物和木质纤维素类物质发酵产生的燃料乙醇，燃烧后尾气排放污染小，但其热值只有普通汽油的2/3，比柴油更低，且乙醇易吸水使燃烧值下降。12微藻制备生物柴油的优势作为新一代生物柴油原料，微藻拥有很多优势。例如微藻种类繁多，分布极其广泛。全球已经鉴定的微藻大约有40000种，且其数量还在不断增加。大多分布在江海湖泊中，不与农作物争地，可以整年生长。微藻通常呈单细胞或丝状体，结构简单，整个生物体都能进行光合作用，所以光合作用效率高，生长周期短、速度快。微藻还可利用微生物发酵技术，在光反应器中高密度、高速率培养。在同样条件下，微藻细胞生长加倍
3、时间通常在24H内，对数生长期内细胞物质加倍时间缩短至35H。微藻油脂含量高。例如葡萄藻（BOTRYOCOCCUSBRAUNII）的含油量为细胞干重的2575。而高等植物种子的脂肪酸含量仅为干重的1520左右。其油脂组成与一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸为主。微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量CO2和氮化物或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。13假微型海链藻假微型海链藻属于中心硅藻纲，圆筛藻目，海链藻属。通过尼罗红染色法对宁波大学微藻种质库的63株微藻进行筛选，研究结果显示，中性脂含量最高的为假微型海链藻（TPSEUDONANA），虽然假微型海链藻的中性脂含量最高，但是其细
4、胞密度在整个生长期都比较低，因此对它的分子研究及培养条件的优化极为重要。131DGATDGAT二酰甘油酰基转移酶催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是该途径的限速酶，对它的研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。另外，DGAT基因全长的克隆为下一步转入到拟南芥中提供目的基因。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1研究的基本内容11假微型海链藻（TPSEUDONANA）DGAT基因全长CDNA的克隆12DGAT基因全长CDNA序列分析、比对2拟解决的主要问题21得到假微型海链藻DGAT基因全长CDNA的克隆22分析和比对DGAT基因全长CDNA序列三、
5、研究的方法与技术路线1假微型海链藻（TPSEUDONANA）DGAT基因全长CDNA的克隆11材料实验材料假微型海链藻（TPSEUDONANA）取自宁波大学微藻种质库，于5000ML三角瓶中，在温度20，盐度2530，光照强度为50MOL/M2S，光暗比12H12H的条件下采用NML3培养液（表1）培养10D。表1NML3培养液配方TABLE1COMPOSITIONOFCULTUREFLUID营养成分含量（G/L）KNO3100KH2PO410EDTANA220C6H5O7FE5H2O1MNSO405VB16103VB125105NA2SIO3212方法121总RNA的提取首先，将三角瓶中的假
6、微型海链藻（TPSEUDONANA）离心，去上清，得到100MG的藻泥于2MLEP管中。然后加入1ML的TRIZOL试剂，超声波清洗机中超声5MIN后提取总RNA。最后用20LDEPC水（RNASEFREE）溶解RNA，测定RNA的浓度和OD260/OD280的值。122反转录合成CDNA的第一条链取各样品RNA1G按TAKARAPRIMESCRIPTTMRTPCRKIT（宝生物工程有限公司）操作方法在一个DEPC水处理过的PCR管中加入总RNA1G，OLIGODTPRIMER25M1L，DNTPMIXTURE（10MMEACH）1L，加RNASEFREEDH2O补至10L，PCR仪上65反应
7、5MIN后，离心数秒使模板RNA、引物等的混合液聚集于PCR管底部。然后加入5PRIMESCRIPTTMBUFFER10L，RNASEINHIBITOR（40U/L）05L，PRIMESCRIPTTMRTASE（FOR2STEP）05L，RNASEFREEDH2O5L，混匀后PCR仪上进行反转录反应3010MIN，4230MIN，955MIN，得到的CDNA产物可直接用于基因全长CDNA的克隆或放20保存。1233RACE引物设计按照NCBI上公布的假微型海链藻（TPSEUDONANA）CCMP1335的DGAT基因的全长序列（XM_0022871791），用PRIMERPREMIER50设计
8、DGAT基因的特异性引物，接头及接头引物由3FULLRACECORESETVER20试剂盒提供（表6）。表6假微型海链藻（TPSEUDONANA）3RACE引物TABLE6PRIMERSIN3RACEOFTPSEUDONANA引物名称PRIMERNAME引物序列PRIMERSEQUENCE（53）3RACEADAPTOR含有由TAKARA独特设计的DT区域及ADAPTORPRIMER部分3RACEOUTERPRIMERTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3RACEINNERPRIMERCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGGGENESPECIFICOUTERP
9、RIMERTTGGGTCGATCTGATATCCGENESPECIFICINNERPRIMERATCATATCCTCCCTCGAAG1243RACE获得DGAT基因全长CDNAOUTERPCR反应体系为50L反转录反应液3L，1CDNADILUTIONBUFFER7L，GENESPECIFICOUTERPRIMER10M2L，3RACEOUTERPRIMER10M2L，10LAPCRBUFFERMG2FREE4L，MGCL2（25MM）3L，TAKARALATAQ（5U/L）025L，DH2O2875L。反应条件943MIN；9430S，5530S，7215MIN，35个循环；7210MIN。
10、INNERPCR反应体系为50L稀释后的OUTERPCR产物1L，DNTPMIXTURE25MMEACH8L，10LAPCRBUFFERMG2FREE5L，MGCL2（25MM）5L，TAKARALATAQ（5U/L）05L，GENESPECIFICINNERPRIMER10M2L，3RACEINNERPRIMER10M2L，DH2O265L。反应条件943MIN；9430S，5530S，7215MIN，35个循环；7210MIN。125测序分析取5LPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，检测3RACEPCR扩增产物。将PCR产物连接到PMD18T受体上，转化到大肠杆菌中再进行测序。13技术路线四、
11、研究的总体安排与进度2010720109查阅资料、预实验等前期准备。20109201011假微型海链藻DGAT基因全长CDNA的克隆201011201012DGAT基因全长CDNA序列分析、比对2011120112整理数据，撰写论文。五、主要参考文献1嵇磊，张利雄，姚志龙等利用藻类生物质制备生物燃料研究进展J石油学报石油加工，2007，236152王金娜，严小军，周成旭，徐继林产油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测生物物理学报2010，2653刘波，孙艳,刘永红，赵宗保产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展微生物学报2005151总RNA的提取反转录合成CDNA的第一条链3RACE引物设计
12、3RACE获得DGAT基因全长CDNA测序、分析4刘源，姜运良猪DGAT1基因部分序列的克隆及分析山东2005年学术年会，2462485李栒油菜种子含油量相关基因PEPC和DGAT的克隆及遗传转化研究湖南农业大学博士论文6马海明，施启顺，柳小春DGAT相关基因的研究进展遗传学报，2005，32（12）132713327NILAIYARAJA,APRAJARANIETCCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFDGATCDNASEQUENCEFROMBRASSICAJUNCEEACVPUSABOLD8EVIRGINIAARBRUST,JOHNABERGES,CHRISBOWLER,
13、THEGENOMEOFTHEDIATOMTHALASSIOSIRAPSEUDONANAECOLOGY,EVOLUTION,ANDMETABOLISM,SCIENCE,VOL306,1OCTOBER,20049BOUVIERP，BENVENISTEP，OELKERSP，STURLEYSL，SCHAIIERHEXPRESSIONINYEASTANDTOBACCOOFPLANTCDNASENCODINGSACYLCOADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEJEURJBIOCHEM，2000，2671859610LUNGSC，WESELAKERJDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJLIPIDS，2006，411210731088
