1、毕业论文开题报告生物工程香鱼C9重组蛋白包涵体纯化洗涤缓冲液的筛选一、选题的背景与意义鱼类体液中几种主要抗菌因子在自身非特异性免疫中发挥着巨大作用。鱼体液中几种主要的抗菌因子有补体、抗菌肽、凝集素、溶茵酶、转铁蛋白、金属硫蛋白等。其中补体系统是先天性免疫的一个重要效应系统。它既是天然免疫防御的一部分，又是体液免疫的效应机制，同时对特异性免疫应答具有调节作用。补体是由血浆补体成分、可溶性和膜型补体调节蛋白、补体受体等30余种糖蛋白组成，是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统。补体重要结构之一末端补体分子C6，C7，C8和C9是构成膜攻击复合体（MAC）引起靶细胞溶解破坏的重要组成成分。其中C9分
2、子是形成MAC的最后一个分子，为单链糖蛋白，分子量是79KD。因此本课题拟通过优化香鱼C9重组蛋白包涵体，为进一步抗血清制备奠定基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是通过原核表达获得大量香鱼C9重组蛋白，并优化纯化方法，获得较纯的重组蛋白，为下一步C9抗血清制备奠定基础。拟解决的问题研究香鱼C9重组蛋白包涵体纯化洗涤缓冲液的筛选。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法221诱导表达挑取单个PET28AC9/BL21PLYSE菌落，涂于含卡那霉素（50G/ML）的LB培养基上，过夜培养14H。在过夜培养后的LB培养基中挑取单个菌落接种于5MLLB培养液（含50G/M
3、L卡那霉素），37摇床培养过夜。取1ML过夜培养的LB培养液，按1100比例稀释，接种于100MLLB培养液（含50G/ML卡那霉素）中，2H后，取1ML作为对照，记作样品1。其余培养液中加入IPTG（终浓度为04MMOL/L），继续培养4H。222菌体破碎将含有构建的表达载体的菌株扩大培养至100ML，在6000RPM下离心10MIN，弃上清，所得沉淀分别用20MLPBS洗涤液重悬浮，进行超声破碎（2S，间隔2S，90次）两次，破碎液中取样100L，记作样品2；其余破碎液13，000RPM离心10MIN，取100L的上清液，记作样品3，取100L的沉淀，记作样品4，其余的上清和样品冷藏保存。
4、223电泳检测目的蛋白是否为包涵体将样品14加入2SDSPAGE上样缓冲液（50MMOL/LTRISHCLPH68，100MMOL/LDTT，2SDS，001溴酚蓝，20甘油），煮沸5MIN，10000RPM离心10MIN后，取上清20L进行SDSPAGE电泳，用未诱导的菌体蛋白和BL21PLYSE菌体蛋白作对照，进行电泳。样品在进入分离胶前用80V，进入分离胶后加至95V。224染色与脱色电泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去浓缩胶，同时切一角作为方向标记，接着用蒸馏水冲洗。用考马斯亮蓝R250（025COOMASSIESBRIGHTBLUER250）染色，室温下，染色2H后转至脱色液中脱色，
5、脱色1H后用清水漂洗至凝胶背景无颜色，蛋白条带清晰，再进行观察、摄像。225包涵体洗涤将含有包涵体超声波破碎液沉淀分成四份，每份10ML，分别用10ML四种不同PBS洗涤液洗涤沉淀。13，000RPM10MIN，去上清后，采用PBS1（含2脱氧胆酸钠）洗涤沉淀，在37在分别振荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品51、52、53。沉淀用PBS2（含05TRITONX100）洗涤，在37在分别振荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品61、62、63。13，000RPM，离心10MIN，去上清，沉淀用PBS3（含05TRITONX1004M尿素）洗涤，在37在分别振
6、荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品71、72、73。13，000RPM，离心10MIN，去上清，沉淀用PBS4（含05TRITONX1004M尿素2脱氧胆酸钠）洗涤，在37在分别振荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品81、82、83。226电泳检测样品58，加入2SDSPAGE上样缓冲液，煮沸5MIN，10000G离10MIN后，取上清20L进行SDSPAGE电泳，37OC染色2H后转至脱色液，脱色至蛋白条带清晰，于纯化前样品2和样品4做比较。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度20109201010毕业论文选题；201010201011进行文献查阅和资
7、料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案；201012开题答辩与综述；201012201012实验试剂准备；20101220112目的蛋白大量表达；2011220113数据和材料整理、分析；2011320115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1李明云,丁天喜,竺俊全等我国香鱼的研究现状及增养殖前景J宁波大学学报理工版,1999,（04）85902李长红,陈炯,史雨红等宁海地区香鱼弧菌病病原菌鉴定J微生物学报,2009,（07）9319373曹克驹,李明云浙江香鱼的地理分布及其开发利用的初步意见J动物学杂志,1983,0563654刘峰,李家乐草鱼免疫因子
8、研究进展J上海海洋大学学报,2009,（04）5025075于善谦,王洪海,朱乃硕等免疫学导论M北京高等教育出版社,1999SDSPAGE电泳检测比较诱导表达PET28AC9/BL21PLYSE菌株包涵体PBS（含2脱氧胆酸钠）洗涤沉淀包涵体PBS（含05TRITONX100）洗涤沉淀包涵体PBS（含05TRITONX1002M尿素）洗涤沉淀收集菌体PBS重悬浮超声破碎包涵体离心离心，检测6FERREIRAAM,IRIGOINF,BREIJOMETALHOWECHINOEOCEGRANULOSUSDEALSWITHCOMPLEMENTJPARASITOLTODAY,2000,164168172
9、7GASQUEP,JONESJ,SINGHRAOSKETALIDENTIFIEATIONOFANASTROCYTECELLPOPULATIONFROMHUMANBRAINTHATEXPRESSESPERFORIN,ACYTOTOXICPROTEINIMPLICATEDINIMMUNEDEFENSEJJEXPMED,1998,18744514608BOHANAKASHTANO,ZIPORENL,DONINNETALCELLSIGNALSTRANSDUEEDBYCOMPLEMENTJMOLIMMUNOL,2004,415835979NGUYENHX,GALVANMD,ANDERSONAJCHARA
10、CTERIZATIONOFEARLYANDTERMINALCOMPLEMENTPROTEINSASSOCIATEDWITHPOLYMORPHONUCLEARLEUKOCYTESINVITROANDINVIVOAFTERSPINALCORDINJURYJJOURNALOFNEUROINFLAMMATION2008JUN2552610CHONDROUMP,LONDOUAV,ZARKADISIKEXPRESSIONANDPHYLOGENETICANALYSISOFTHENINTHCOMPLEMENTCOMPONENTC9INRAINBOWTROUTJFISHSHELLFISHIMMUNOL2006N
11、OV215572611HOLLANDMC,LAMBRISJDTHECOMPLEMENTSYTEMINTELEOSTSJFISHSHEFISHIMMUNOL,2002,1239942012SUNYERJO,LAMBRISJDEVOLUTIONANDDIVERSITYOFTHECOMPLEMENTSYSTEMOFPOIKILOTHERMICVERTEBRATESJIMMUNOLREV,1998,166395713LAMMENSM,DECOSTEREA,HAESEBROUEKFEFFECTSOFFLAVOBACTERIUMPSCHROPHILUMSTRAINSANDTHEIRMETABOLITESO
12、NTHEOXIDATIVEACTIVITYOFRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSPHAGOCYTESJDISAQUATORG,2000,4117317914李军,刘美杰,李勇等重组蛋白包涵体的研究进展J安徽农业科学,2008,31135521355415HOFFMANNF,VANDENHEUVELJ,ZIDEKNMINIMIZINGINCLUSIONBODYFORMATIONDURINGRECOMBINANTPROTEINPRODUCTIONINESCHERICHIACOLIATBENCHANDPILOTPLANTSCALEJENZYMEMICROBTECHNOL,2
13、004,3423524116CARRIMM,VILLAVERDEACONSTRUCTIONANDDECONSTRUCTIONOFBACTERIALINCLUSIONBODIESJJBIOTECHNOL,2002,9631217邝爱丽,陈圆圆,彭志峰等包涵体的形成原因及其处理方法J上海畜牧兽医通讯,2009,01626318龙建银,王会信外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展生物化学与生物物理进展,1997,24212613119PALMERI,WINGFIELDPTPREPARATIONANDEXTRACTIONOFINSOLUBLEINCLUSIONBODYPROTEINSFROMESCHERI
14、CHIACOLIJCURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE,2004,16413114320SELLECKW,TANSRECOMBINANTPROTEINCOMPLEXEXPRESSIONINECOLIJCURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE,2008,21532432121WUPC,CHIENMS,TSENGYYETALEXPRESSIONOFTHEPORCINECIRCOVIRUSTYPE2CAPSIDPROTEINSUBUNITSANDAPPLICATIONTOANINDIRECTELISAJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,
15、2008,13323586422纪剑飞,张成刚包涵体重组蛋白的纯化及复性J沈阳药科大学学报,1998,23430330723王增,马会勤,张文包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展J中国生物工程杂志,2009,0710210724姜炜鹏,左金华,李继奎等以TRITONX100和脱氧胆酸钠为萃取剂制备兔脱细胞神经基质有最佳时间吗J中国组织工程研究与临床康复,2009,（47）9241924425BENNIONBJ,DAGGETTVTHEMOLECULARBASISFORTHECHEMICALDENATURATIONOFPROTEINSBYUREAJPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES,2003,10095142514726艾恒,莫书荣,鲁波包涵体研究进展J中国医学文摘内科学,2006,02109111
