1、毕业论文开题报告生物技术两株弧菌的分子鉴定一、选题的背景与意义弧菌在自然环境中分布广泛，生境多样。从淡水到混水，再到海水，尤其是有机质丰富的海淡水汇合的港湾。温度、盐度、有机营养等受潮汐、暴雨的影响波动很大，对弧菌的冲击也很大。同时弧菌既能游离生活，又能与其他生物附生或共生，有些还是人类和/或养殖动物的条件致病菌。弧菌的水生生态学研究表明，水生环境对弧菌的时空分布及相关疾病的爆发都起着非常重要的作用。核糖体是细菌唯一的细胞器，其16SRRNA在进化中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，常用于细菌的鉴定与分类研究。1977年，CWEOSE等在分析原核生物16SRRNA和真核生物18SRRNA序列
2、的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（DOMAIN），揭示了各生物之间的系统发育关系，为弧菌分类与鉴定提供了理论和实践基础。16SRRNA基因序列包含10个可变区VARIABLEREGION和11个恒定区CONSTANTREGION，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关。在生物进化的漫长过程中，其基因序列的变化非常缓慢，因此可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系。迄今为止已有许多弧菌的的全序列16SRRNA基因得以破译并免费公布，十分方便进行类似序列的比较分析。随着研究的深入，逐渐建立了以16SRRNA基因为分类标准的各大数据库例如GENEBENK、EMBL
3、等。这些数据库为广大的分类及分子研究的科研院所以及学者提供了强大的数据支持。本研究采用一对弧菌16SRRNA基因引物通用PCR扩增两株未知弧菌的部分16SRRNA基因，对基因扩增片段做进一步的序列测定，通过序列同源性分析显示，从而确定该弧菌的分类学地位。该方法是一种十分方便有效的弧菌鉴定方法，可在实践中加以推广应用。通过此项课题为进一步探究16SRRNA基因在弧菌鉴定上发挥的作用和寻找防治致病弧菌的新方法提供理论依据。同时为研究弧菌群落演替提供技术支撑，为揭示弧菌的生态学和流行病学规律具有重要意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是对采样获取的两株弧菌中提取其总DN
4、A，获得该两株菌的16SRRNA基因，并进行分子鉴定与序列分析及进化树构建。拟解决的问题16SRRNA基因与其他高分辨基因如RECA基因等相结合进行对弧菌进行鉴定和系统发育树分析。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1实验材料本实验材料为从环境样品中提取出的两株弧菌，进分离纯化后接种到培养皿培养备用。2形态学特征和生理生化鉴定菌落大小、表面形态、边缘、质地和光泽等特征进行初步鉴定。3总DNA提取1、大试管液体扩繁，收集10ML培养液，离心；2、加入2MLTE悬浮菌体，溶菌酶100UL（50MG/ML）、RNASEA10UL10MG/ML，摇匀；水浴30MIN3、加入120UL10SDS和蛋白
5、酶K20MG/ML10UL60水浴30MIN1H4、加入500UL5MOL/LNACL，320ULCTAB/NACL，65水浴10MIN5、3ML酚氯仿25241抽提一次（一定要混匀）6、转移上清后用等体积氯仿异戊醇241抽提1次7、加入1/10体积的3MOL/LNAAC，06体积异丙醇沉淀DNA8、用70的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质。9、所得的沉淀DNA用50UL水溶解，加入50UL的5MOL/L的NACL溶液，充分混匀。加入06倍体积的异丙醇沉淀后重新70酒精洗涤。风干后，
6、用25UL水溶解样品。10、风干后，用50UL水溶解样品，20保藏。4PCR方法测定获取目的基因序列16SRRNA基因PCR扩增设计两个引物。在20TA反应体系中含有无菌蒸馏水144L，1PCR缓冲液2L，15MMOL/LMGCL216L，4DNTP混合物04L，引物各02L，25U/L的TAQDNA聚合酶02L，模板DNA1L。PCR反应条件为95预变性3MIN、接94变性LMIN、55复性1MIN和72延伸2MIN，30个循环后72温育6MIN。5随机测序及序列分析琼脂糖凝胶检测PCR产物，预期大小的扩增条带回收后克隆至PMD19T载体，对序列进行序列测定。序列测定和分析采用ABIPRIS
7、MTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定。序列分析采用BLASTP分析软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DDBJ软件CLUSTALW程序HTTP/CLUSTALWDDBJNIGACJP/，等电点分析采用EXPASY软件HTTP/WWWEXPASYCH/，系统进化分析由MEGA40版程序完成TAMURAETAL，2007。6菌种分类位置确定根据细菌形态、培养基理化特性测定的结果，依据相关资料，并结合细菌发育学分析的结果，进行分离菌的种属分类位置判定（二）技术路线四、研究的总体安排与进度20109201010毕业论文选题20101020
8、1011进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。20101120111获得弧菌的16SRRNA基因，对其进行BLAST分析，比对分析和16SRRNA基因进化树构建，确定其分类学地位。2011120112数据和材料整理、分析。2011220113开题答辩与综述。弧菌分离纯化菌株形态特征确定这两株菌的分类学地位菌株生长曲线测定弧菌总DNA的提取序列分析多重序列比对系统进化分析随机测序与序列分析16SRDNA序列的PCR扩增环境样品2011320115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社2001
9、1061282CRISTIANECTHOMPSON,ANACAROLINAPVICENTE,RANGELCSOUZAGENOMICTAXONOMYOFVIBRIOSJBMCEVOLUTIONARYBIOLOGY2009,9258213121483WOESECR,FOXGEPHYLOGENETICSTRUCTUREOFTHEPROKARYOTICDOMAINTHEPRIMARYKINGDOMSJPROCNATLACADSCIUSA1977,7411508850904WILLIAMS,WILLKINS,BALTIMOREBERGEYSMANUALOFSYSTEMAICBACTERIOLOGYM19
10、862842965THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,18813459245966WOESECRBACTERIALEVOLUTIONJMICROBIOLREVL987,512212717DUBNAUD,SMITHI,MORELLP,ETALGENECONSERVATIONINBACILLUSSPECIESCONSERVEDGENETICANDNUCLEICACIDBASESEQUENCEHOMOLOGIESJPMCNAILACADSCIUSA1965
11、,5424914988HUNTDE,DAVIDLA,GEVERSDRESOURCEPARTITIONINGANDSYMPATRICDIFFERENTIATIONAMONGCLOSELYRELATEDBACTERIOPLANKTONJSCIENCE2008,32058108110859YAMAMOTOS,HARAYAMASPCRAMPLIFICATIONANDDIRECTSEQUENCINGOFGYRBGENESWITHUNIVERSALPRIMERSANDTHEIRAPPLICATIONTOTHEDETECTIONANDTAXONOMICANALYSISOFPSEUDOMONASPUTDAST
12、RAINSJAPPLENVIRONMICROBIOL1995,6131104110910杨鸢劫,俞菊华,陈辉等暗纹东方鲢非O1群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测J水产学报2006,30452553011BIOSCAEG,OLIVERJD,AMAROCPHENOTYPICCHARACTERIZATIONOFVIBRIOVULNIFICUSBIOTYPE2,ALIPPOLYSACCHARIDEBASEDHOMOGENEOUSOSERIGRAPHWITHINVIBRIOVULNIFICUSJAPPLENVIMICROBIOL1996,66391892712FOUZB,AMAROCISOLATIONOFA
13、NEWSEROVAROFVIBRIOVULNIFICUSPATHOGENICFOREELSCULTUREDINFRESHWATERFARMSJAQUACULTURE2003,21767768213韩先朴,卢全章鳗鲡弧菌病病原的分离与鉴定J微生物学报1984,24438639114林天龙,许斌福,董传甫等鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定J中国人兽共患病杂志2005,211199599715王国良,金珊,薛良义等海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究J黄渤海海洋2000,183858916郭明元,刘广锋,冯娟1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析J中国水产科学2006,13582382817朱传华,
14、何建国,黄志坚网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究J中山大学学报2000,39327828218THOMPSONC,THOMPSONK,VANDEMEULEBROECKEK,ETALUSEOFRECAASANALTERNATIVEPHYLOGENETICMARKERINTHEFAMILYVIBRIONACEAEJINTERNATIONALJOURNALOFSYSTEMATICANDEVOLUTIONARYMICROBIOLOGY2004,545,91992419塞文婴,东秀珠定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用J微生物学通报2000,27537738120谢珍玉,胡超群弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展J热带海洋学报2005,243869521LINKOUSDA,OLIVERJDPATHOGENISISOFVIBRIOVULNIFWUAMINIREVIEWJFEMSMICROBIOLLETTERS1999,1741620721322於剑,艾必燕,樵星芳等16SRRNA的高级结构分析在细菌分类鉴定上的应用J重庆中草药研究2010,61293223李献梅,王小芬,杨洪岩等促旋酶B亚单位基因GYRB在鉴别细菌近缘种中的应用J微生物学报48570170624邴旭文,阎斌伦,张晓君等泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定J海洋与湖沼2009,406692698
