1、毕业论文开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫HSP90的分子鉴定一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI，在日本，又名妃新贝尼登虫隶属于扁形动物门PLATYHELMINTHES，吸虫纲MONOGENEA，单后盘目MONOPISTHOEOTYLEA，分室科CAPSALIDAEBARID，1853，新贝尼登虫属NEOBENEDENIAYAMAGUTI,1963。世界上广为分布（热带和亚热带地区），在我国，广泛寄生于南方海水网箱养殖的名贵经济鱼类如大黄鱼、红甘鰺、石斑鱼和鲷科鱼类的体表、腮或鼻腔等处，在5个目30多个科100多种鱼体上都有发现，显示出很低的宿主特异性。该寄生
2、虫常寄生在鱼类的体表、鳍和鳃丝等部位，虫体破坏鱼类粘液组织，大量吸取宿主血液，吞食宿主组织细胞，而且经常并发细菌感染，引起宿主鳃呼吸困难，体表大面积肌肉组织脱落，溃疡糜烂，病变部位多呈“火山口”状。虫体严重危害宿主生存，导致病鱼烦躁不安，食欲降低、厌食或拒食，不久即因衰竭而死亡。近年来，此寄生虫的病虫害在我国东南沿海一带频繁出现，影响十分严重，造成很大的经济损失，且危及沿海水产养殖业的发展。热休克蛋白HEATSHOCKPROTEINS，HSPS是机体在应激病毒感染、缺氧、紫外线照射等状态下，合成的一组高度保守的蛋白质分子，故又称为应激蛋白。广泛存在于原核和真核生物中，多以分子伴侣的形式参与相关
3、蛋白的折叠、装配、细胞内运输及蛋白质降解等过程。按照分子质量大小，可被分为六大家族，即HSP110104170KD、HSP908396KD、HSP706678KD、HSP605865KD、HSP403247KD、SHSP1028KD。HSP90是细胞内最活跃的分子伴侣之一，广泛参与细胞的信号转导、激素应答及转录调控过程，对细胞在生理、病理及应激条件下的生存发挥了重要作用。并且和肿瘤发生、微生物耐药性和动物发育等有关，成为当前研究的热点。本课题主要通过对梅氏新贝尼登虫的RNA提取，获取HSP90的基因序列，初步分析其特征和功能，并进行PCR实验以分析其HSP90的表达，为进一步弄清HSP90的功
4、能和寻找防治此类病虫害的方法提供理论基石。二、本课题研究的内容与拟解决的主要问题研究的内容（1）提取梅氏新贝尼登虫总的RNA，获得梅氏新贝尼登虫HSP90蛋白的基因序列；（2）进行HSP90基因序列的分析及进化树构建分析；（3）发育期间梅氏新贝尼登虫虫卵、钩毛蚴、成虫三个发育阶段HSP90的表达。拟解决的问题（1）获取梅氏新贝尼登虫的HSP90基因序列；（2）梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP90表达分析。三、研究方法和技术路线研究方法1）梅氏新贝尼登虫样品的采集本次课题中的实验用虫采集于宁波象山黄避岙三个发育阶段的虫体成虫采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，咸淡水浸泡病鱼后
5、，用镊子小心取下体表成虫，暂养于过滤海水中至肠道内含物排空，过滤海水冲洗虫体粘液后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。虫卵采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，回流过滤器过夜抽滤，抽滤物经镜检观察分离出虫卵，过滤海水浸洗后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。钩毛蚴将上述方法收集的虫卵放入盛有新鲜过滤海水的培养皿中，置于25人工智能气候箱中培养，每天镜检观察虫卵发育情况并更换新鲜过滤海水，约46天钩毛蚴逸出后收集于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。2）总RNA抽提利用RNAISO试剂提取梅氏新贝尼登虫总RNA1将7
6、0保存的样品加入1MLRNAISO以下为加入1MLTRIZOL试剂标准，匀浆机匀浆。2匀浆后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM离心5MIN。3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN。412
7、000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。8RNA样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD260/OD
8、28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯化采用OLIGOTEXDT30进行纯化。3）CDNA文库的构建文库的构建包括逆转录成双链，接头连接，连接到特异性载体上，转化等。试验中所使用的技术和方法都比较成熟，可行性高。4）荧光定量PCR采用实时荧光定量PCR（QUANTITATIVEREALTIMEPCR，QRTPCR）来研究梅氏新贝尼登虫HSP90基因MRNA转录水平的变化。根据LIVAKSCHMITTGEN（2001）提出的相对标准曲线法2CT对相对定量的
9、结果进行分析，获得梅氏新贝尼登虫肝组织HSP90基因MRNA的相对表达量。发育期间HSP90基因表达的差异用SPSS软件（130）中的单因素方差分析法（ONEWAYANOVA）进行分析，以P005为显著性差异。5）序列分析和进化树构建同源比对采用BLAST软件（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/），信号肽序列预测采用SIGNALP30系统（HTTP/WWWCBSDTUDK/SERVICES/SIGNALP/），多重序列比对采用CLUSTALW程序（HTTP/CLUSTALWDDBJNIGACJP/），系统进化树构建采用MEGA40（TAMURAETAL,2007）。技术路
10、线四、研究的总体安排与进度2010年10月份做有关文献的收集和阅读。2010年12月份做开题报告及文献综述。论文撰写及答辩使用SPSS软件分析数据，显示差异性序列分析多重序列比对系统进化分析测定发育各阶段的HSP90MRNA表达量并进行分析从鱼体上采集成虫（用刀），其中部分用液氮保存，其余用于下一步实验将成虫置于水盆中过夜以产卵，采集部分虫卵并用液氮保存余下虫卵置于25下孵化（6天）收集孵化出的钩毛蚴，并用液氮保存梅氏新贝尼登虫总RNA的提取随机测序及序列分析文献查阅和课题设计样本的采集和总RNA的提取构建寄生虫CDNA文库2010年12月2010年1月份做实验及实验数据的统计。2011年2月
11、210年4月做实验数据的分析和毕业论文。2011年5月做毕业论文答辩五、主要参考文献1HARTLFU,HAYERHARTLMMOLECULARCHAPERONESINTHECYTOSOLFROMNASCENTCHAINTOFOLDEDPROTEINJSCIENCE,2002,295185218582胡秀娟,王雪峰HSP90在肿瘤中的研究医学综述,2008,L413RUTHEFRORDSL,LINDQUISTSHSP90ASACAPACITORFORMORPHOLOGICALEVOLUTIONJNATURE,1998,39667093363424PANDEYP,SALEHA,NAKAZAWAA,
12、ETA1NEGATIVEREGULATIONOFCYTOEHORMECMEDIATEDOLIGOMERIZATIONOFAPAF1ANDACTIVATIONOFPROEASPASE9BYHEATSHOCKPROTEIN90JEMBOJ,2000,1916431043225BLAGOSKLONNYMV,TOERTSKYJ,BOHENS,ETALMUTANTCONFORMATIONOFP53TRNASLATEDINVITROORINIVVOREQUIERSFANCTIONALHSP90JPORENATLACADSCIUSA,1996,9316837983836SHIONOY,FUJITAY,OKA
13、S,ETALATPASEINHIBITORSSUPPERSSACTINOMYCINDINDUCEDAPOPTOSISINLEUKEMIACELLSJANIFCANCERRES,2002,225290729117ZHAOC,WNAGEHHEATSHOCKPORTEIN90SUPPRESSESTUMOMECORSISFACTORSINDUCEDAPOPTOSISBYPREVENTINGTHECLEAVAGEOFBIDINNIH3T3IFBORBLASSTJCELLSIGNAL,2004,1633133218YANOM,NLATOZ,TNAAKAS,ETA1EXPRESIONANDROLESOFHE
14、ATSHCOKPROTEINSINHUMANBREASTCANCERJJPNJCANCERRES,1996,8799089159刘宪玲,叶苓,王建波等热休克蛋白HSP90在人胃癌组织及耐药细胞系中的表达J第四军医大学学报,2000,21213113410GORSSTM,MULLERPILLASCHF,WEBERC,ETA1DIFERENTIALEXPRESIONOFHEATSHOCKPROTEINSINPANCREATICCARCINOAMJCANCERRES,1994,54254755111施一江,赵攻,许先发等主要人热休克蛋白在癌组织及癌旁正常组织中表达水平的比较研究J中华肿瘤学杂志,19
15、98,20427727912SRIVASTAVAPKIMMUNOTHERAPYFORHUMANCANCERUSINGHEATSHOCKPROTEINEPPTIDECOMPLEXESJCURRONCOLREP,2005,7210410813WEGELEH,MULLERL,BUCHNERJHSP70ANDHSP90ARELAYTEAMFORPROTEINFOLDINGJREVPHYSIOLBIONCHEMPHARMACOL,2004,15114414COWENL,LINDQUISTSHSP90POTENTIATESTHERAPIDEVOLUTIONOFNEWTRAITSDRUGRESISTANCE
16、INDIVERSEFUNGIJSCIENCE,2005,3092185218915COWENLETHEEVOLUTIONOFFUNGALDRUGRESISTANCEMODULATINGTHETRAJECTORYFROMGENOTYPETOPHENOTYPEJNATREVMICROBIOL,2008,6318719816WADDINGTONCHGENETICASSIMILATIONOFANACQUIREDCHARACTERJEVOLUTION,1953,711812617PACAYS,BANEDIU,JUDSONI,ETA1HSP90INHIBITORSINTHECLINICJHANDBEXPP
17、HARMACOL,2006,17233135818KUMARR,MUSIYENKOA,BARIKSPLASRNODIUMFALCIPAURMCALCINEURINANDITSASSOCIATIONWITHHEATSHOCKPROTEIN90MECHANISMSFORTHEANTIMALARIALACTIVITYOFCYCLOSPORINAANDSYNERGISMWITHGELDANAMYCINJMOLBIOCHEMPARASITOL,2005,141293719马炳田,万佳等水稻中一个与OSHSP90互作的新基因特性分析中国水稻科学,2009,23434234820刘大丽,张欣欣,程玉祥等逆境下水稻ORYZASATIBALRHSP90基因的克隆及功能分析分子植物育种,2006,4331732221李玉保,鲍恩东HSP70和HSP90荧光定量RTPCR检测方法的建立南京农业大学学报,2008,31211612022周向红,阎斌伦一条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR检测方法的构建淮海工学院学报,2010,192818423左东升,范婕热休克蛋白90在人胃癌与癌旁及淋巴结转移癌中表达的研究张家口医学院学报,2002,1954524欧阳涓,姜傥HSP90在原发性肾病综合征发生和治疗中的意义中山大学学报,2006,276661666
