1、毕业论文开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI，在日本，又名妃新贝尼登虫是单殖目、分室科、新贝尼登虫属生物，世界上广为分布，在我国，广泛寄生于南方海水网箱养殖的名贵经济鱼类如大黄鱼、高体鰤、石斑鱼和鲷科鱼类的体表、眼眶或鼻腔等处。温度较高时，此寄生虫快速繁殖生长，易使上述感染对象患上夏秋季综合症，鱼类受感染的数量和程度都很大，受到感染的鱼极为难受，不停游动或擦网，寄生虫会破坏鱼类的表面粘液组织，诱发细菌和寄生纤毛虫感染，从而导致体表导致渔区网箱养殖鱼类大批死亡。特别是近年来频繁出现在我国东南沿海一带的
2、新贝尼登虫病，其带来的影响十分严重，不仅会危及到我国东南沿海水产养殖业的发展，同时，当地大量鱼类的受害会间接导致与之相关的生物圈发生巨大的变化，甚至有可能导致生态失衡。热休克蛋白HEATSHOCKPROTEINS,HSPS又称为应激蛋白，是在细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质。它是生物细胞在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。目前已发现在环境胁迫因子如高温、重金属和微生物感染等的刺激下，其表达量显著增加。许多热休克蛋白具有分子伴侣的性质，因此HSP是一些在进化上非常保守的蛋白质家族。依蛋白质分子大小，
3、可以将热休克蛋白分为五类，即HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白SMHSP。HSP70蛋白质家族是其中功能上较广的一种，也是被研究的最为深入的一种HSP蛋白。它不仅能够在热胁迫下表达，而且几乎是所有活体细胞中的重要成分。HSP70家族作为分子伴侣在许多生物学过程中起到了重要作用。因此，研究HSP70家族及其系统的功能结构十分重要。由于HSP在进化过程中的高度保守性，作为一种有效的分子标记，不少学者通过HSP序列分析研究分子流行病和系统进化之间的关系。本课题通过提取梅氏新贝尼登虫的RNA，使用PCR技术获取其HSP70序列，并分析其表达和功能表征，从而研究不同发育
4、阶段梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达，为进一步探究HSP70在动物体内的功能和防治此类病虫害的方法提供理论基础，同时构建出来的进化树可以用于比较分析不同物种的HSP70氨基酸序列特征，以期为这些鱼类的抗逆、应激效应的深入研究提供依据。二、本课题研究的内容与拟解决的主要问题研究的内容本课题主要研究的是1梅氏新贝尼登虫成虫、虫卵和钩毛蚴三个发育阶段样品的获得和保存；2提取各个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA；3通过随机测序方法得到HSP70的基因序列；4对获得的HSP70序列进行分析，而后进行进化树的构建、分析；5采用荧光定量PCR，检测三个不同发育阶段的梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达差异。拟解决
5、的问题1获取不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA2获得梅氏新贝尼登虫的HSP70的CDNA序列3梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析及进化树分析三、研究的方法与技术路线研究方法1梅氏新贝尼登虫样品的收集本次课题中的实验用虫采自宁波象山黄避岙三个发育阶段的虫体成虫采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，咸淡水浸泡病鱼后，用镊子小心取下体表成虫，暂养于过滤海水中至肠道内含物排空，过滤海水冲洗虫体粘液后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。虫卵采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，回流过滤器过夜抽滤，抽滤物经镜检观察分离出虫卵，过滤海水浸洗
6、后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。钩毛蚴将上述方法收集的虫卵放入盛有新鲜过滤海水的培养皿中，置于25人工智能气候箱中培养，每天镜检观察虫卵发育情况并更换新鲜过滤海水，约46天钩毛蚴逸出后收集于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。2）RNA抽提并纯化从已采集的样本中提取各发育阶段的RNA利用RNAISO试剂提取上述样本中提取RNA1将100MG70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1MLRNAISO组织以下为加入1MLTRIZOL试剂标准。2研磨后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM离心5MIN。
7、3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN。412000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干燥，用DEPC
8、水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。8RNA样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD260/OD28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯化采用OLIG
9、OTEXDT30进行纯化。3基因克隆与随机测序在提取梅氏新贝尼登虫RNA后，用OLIGOTEXDT30纯化MRNA，以其为模板，采用CDNALIBRARYCONSTRUCTIONKIT构建梅氏新贝尼登虫CDNA文库，具体方法参照厂家说明。随机挑选一些克隆，部分测序并经BLASTP（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/）分析，测通与已知物种HSP70基因序列相似的插入片段克隆。4荧光定量PCR采用实时荧光定量PCRREALTIMEFLUORESCENTQUANTITATIVEPCR，QRTPCR来检测梅氏新贝尼登虫HSP70的表达差异。1利用已提取的RNA序列，进行第一链CD
10、NA合成。25LPCR的反应体系包括SYBRPREMIXEXTAQ2缓冲液125L，引物各1L，模板05L。扩增反应在STRATAGENEMX3000P荧光定量PCR仪上进行，程序为94180S1个循环2进入扩增阶段，共40个循环，每一循环包括9430S，5830S，7230S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9430S，7260S，9530S1个循环。为保证PCR结果的准确性，每一个样品重复分析3次，包括目标基因HEPCIDIN和看家基因ACTIN。3荧光定量的结果采用仪器自带程序MXPRO32读取。4根据LIVAKSCHMITTGEN2001提出的相对标准曲
11、线法2CT对相对定量的结果进行分析，获得梅氏新贝尼登虫HSP70基因MRNA的相对表达量。HSP70基因表达的差异用SPSS软件130中的单因素方差分析法ONEWAYANOVA进行分析，以P005为显著性差异。5序列分析与进化树构建同源比对使用BLAST软件来自于NCBI官网上的BLAST分析系统；信号肽序列预测使用SIGNALP30系统源于HTTP/WWWCBSDTUDK/SERVICES/SIGNALP/；多重序列比对使用CLUSTALW程序；系统进化树构建采用MEGA40TAMURAETAL,2007技术路线见下页四、研究的总体安排与进度第七学期2010年10月毕业论文选题,而后开始收集
12、有关课题的资料，并与老师交流，了解课题的目的、意义以及方法2）将用于产卵的成虫置于水盆中过夜。第二天，成虫产下虫卵，用于收集RNA的部分用液氮保存，其余的虫卵用于孵化3）将余下虫卵置于25的环境孵化（6天）。收集孵化出的钩毛蚴，并用液氮保存基因克隆,并通过随机测序方法获得HSP70基因序列HSP70CDNA序列梅氏新贝尼登虫不同发育阶段样本的采集提取三个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA1）用刀从鱼体上采集成虫，用于收集RNA的部分用液氮保存，其余用于产卵的则放入水盆中数据整理总结，撰写并完成论文荧光定量PCR1）第一CDNA链合成2）扩增阶段（40个循环）3）用MXPRO32读取荧光定量的结果获
13、得HSP70基因MRNA的相对表达量序列分析和进化树构建HSP70CDNA序列4检测不同发育阶段的梅氏新贝尼登虫HSP70的表达差异HSP70CDNA序列2010年11月12月根据已经整理的材料，撰写文献综述、任务书和开题报告，并进入实验室了解实验相关细节2010年12月进行开题报告及文献综述，修改并完善相关材料，为进一步的实验做好准备2010年12月2011年3月进行实验及数据的收集、统计（正式实验第一阶段样本收集2010年78月第二阶段RNA提取2010年12月提取三个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA第三阶段获得序列2010年3月通过随机测序获得HSP70基因序列，进而进行序列分析和进化树构
14、建第四阶段表达分析2010年3月通过荧光定量PCR检测不同发育阶段的HSP70的表达差异）第八学期2011年3月2011年4月对实验数据进行整理、分析发育各阶段的HSP70MRNA表达量进行分析，以及使用SPSS软件分析数据和显著差异2011年3月2011年4月完成2篇英文翻译，论文的撰写和提交2011年5月完成毕业论文的答辩五、主要参考文献1杨文川,李立伟,石磊等妃新本尼登虫单殖目多室科的发育J动物学报,2002,48175792杨丽华大黄鱼的病害防治J渔业致富指南,2002,4543杨文川,李立伟,石磊等福建海水养殖鱼类寄生贝尼登虫病原学研究J台湾海峡,2001,2022052094OGA
15、WAK,BONDADREANTASOMG,FUKUDOMEM,ETALNEOBENEDENIAGIRELLAEHARGIS,1955YAMAGUTI,1963MONOGENEACAPSALIDAEFROMCULTUREDMARINEFISHESOFJAPANJJPARASITOL,1995,8122232275OGAWAK,MIYAMOTOJ,WANGJH,ETALNEOBENEDENIAGIRELLAEMONOGENEAINFECTIONOFCULTUREDCOBIARACHYCENTRONCANADUMINTAIWANJFISHPATHOLOGY,2006,41251566DYERWG,W
16、ILLIAMSEH,JR,ETALNEOBENEDENIAPARGUERAENSISNSPMONOGENEACAPSALIDAEFROMTHEREDHIND,EPINEPHELUSGUTTATUS,ANDCOMMENTSABOUTNEOBENEDENIAMELLENIJJPARASITOL,1992,7833994017XUPJ,XIAOJH,LIUL,ETALMOLECULARCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFFOURHEATSHOCKPROTEINGENESFROMMACROCENTRUSCINGULUMHYMENOPTERABRACONIDAEJMOLBIOLREP
17、,2010,37226522728凌明圣,徐明波,姚志坚分子伴侣HSP70研究进展J国外医学分子生物学分册,1993,1552272309张玉秀,柴团耀HSP70分子伴侣系统研究进展J生物化学与生物物理进展,1999,26655455810NAKAMURAK,ROKNTANK,MARUIN,ETALINDUCTIONOFHEATSHOCKPROTEINSANDTHEIRIMPLICATIONINPROTECTIONAGAINSTETHANOLINDUCEDDAMAGEINCULTUREDGUINEAPIGGASTRICMUCOSALCELLSJGASTROENTEROLOGY,1991,101
18、716116611EBERTMP,SCHAFERC,CHENJ,ETALPROTECTIVEROLEOFHEATSHOCKPROTEIN27INGASTRICMUCOSALINJURYJJPATHOL,2005,207217718412WADAI,OTAKAM,JINM,ETALEXPRESSIONOFHSP72INTHEGASTRICMUCOSAINREGULATEDBYGASTRICACIDINRATCORRELATIONOFHSP72EXPRESSIONWITHMUCOSALPROTECTIONJBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2006,349261161813TAKAO
19、S,TETSUOK,KATSUMASAG,ETALPOSSIBLEROLEOFCALCINEURININHEATINGRELATEDINCREASEOFRATMUSCLEMASSJBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS,2005,33141301130914PELLECCHIAM,SZYPERSKITNMRSTRUCTUREOFTHEJDOMAINANDTHEGLY/PHERICHREGIONOFTHEESCHERICHIACOLIDNAJCHAPERONEJJMOLBIOL,1996,260223625015QIANYQ,PATELD,
20、HARTLFU,ETALNUCLEARMAGNETICRESONANCESOLUTIONSTRUCTUREOFTHEHUMANHSP40HDJ1JDOMAINJJMOLBIOL,1997,7312913316SONGJY,LIL,AHNJB,ETALACUTELIVERTOXICITYBYCARBONTETRACHLORIDEINHSP70KNOCKOUTMICEJEXPERIMENTALANDTOXICOLOGICPATHOLOGY,200759293417KIMURAY,YAHARAILINDQUISTSROLEOFTHEPROTEINCHAPERONEYDJ1INESTABLISHING
21、HSP90MEDIATEDSIGNALTRANSDUCTIONPATHWAYSJSCIENCE,1995,26852151362136518LIX,SURTC,HSUH,ETALTHEMOLECULARCHAPERONECALNEXINASSOCIATESWITHTHEVACUOLARHATPASEFROMOATSEEDLINGSJPLANTCELL,1998,10111913019HARTLFUMOLECULARCHAPERONESINCELLULARPROTEINFOLDINGJNATURE,1996,381658357158020BUKAUB,HORWICHALTHEHSP70ANDHS
22、P60CHAPERONEMACHINESJCELL,1998,92335136621HENDRICKJP,HARTLFUMOLECULARCHAPERONEFUNCTIONOFHEATSHOCKPROTEINSJANNUREVBIOCHEM,1993,6234938422TERADAK,MORIMMITOCHONDRIALPROTEINIMPORTINANIMALSJBIOCHIMBIOPHYSACTA,1998,14031121723张文利,曹宁,杨靖,高雪芹HSP60HSP70HSP90在结直肠癌癌旁组织的表达及与病理分级的关系J济宁医学院学报,2009,326390392,39524赵桢
23、,王晓涛,陈兰英等人食管癌及宫颈癌组织中HSP70基因的表达J中国生物制品学杂志,2005,18210925薛淑慧HSP70蛋白在胃溃疡组织中表达的临床意义J海南医学,2009,201054,7026李玉琴,黄民,王英凯等热休克蛋白70在消化性溃疡及急性糜烂出血性胃炎组织中的表达及意义J吉林大学学报医学版,2008,34584684927赵紫婷,王建平,苏士文,王佩佩大鼠磨牙牙髓组织在程度不同的机械性损伤刺激后HSP70的表达及意义的研究J口腔医学,2010,30633934228李传明,石佑恩寄生虫热休克蛋白及其在血吸虫方面的研究进展J国外医学寄生虫病分册,1996,23519319729苏
24、洁,蔡宏,朱玉贤结核分枝杆菌热休克蛋白HSP70在原核表达载体中的克隆表达与鉴定J中国人兽共患病学报,2006,22871271530王瑞,黄艳华,陈明,梁万文,黄钧罗非鱼感染链球菌后HSP70基因表达研究J广西农业科学,2010,41437137431齐晶,闵连秋低氧预处理对缺血脑组织HSP70蛋白表达的影响J中国民康医学,2008,20991393532高宇,袁改玲,李大鹏,陈昌福杂交鲟和匙吻鲟HSP70CDNA克隆与序列分析J华中农业大学学报,2010,291858933袁继红实时荧光定量PCR技术的实验研究J现代农业技术,2010,13202234明建华,谢俊,刘波等团头鲂HSP70CDNA的克隆、序列分析以及热应激对其MRNA表达的影响J中国水产科学,2009,16563564835尹兵实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展J科技信息,2010,1730,5936袁金钱,路义鑫,韩彩霞,宋铭忻本地毛形线虫HSP70基因的克隆与序列分析J中国兽医科学,2007,3712106210637计红,吴永魁,胡仲明等不同强度冷应激下仔猪淋巴细胞HSP70MRNA的转录规律J应用与环境生物学报,2007,13450750938倪吴花,俞康,吴建波荧光定量PCR检测肝癌组织GPC3、HSP70基因表达的临床意义J实验与检验医学,2008,265517519
