1、第三章 介绍生物转化的常见反应类型,以甾体化合物的生物转化为例进行阐述甾体化合物和甾体药物简介 甾体化合物结构 甾类化合物常见种类,甾体化合物和甾体药物简介,1952年，美国普强药厂的Morray和Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化为11黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转化在甾体药物生产中的重要性。微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转化。几种重要的甾体微生物转化发应如羟化，脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要手段,甾体化合物,一类含有环戊烷多菲核的化合物在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羟基、酮基；A，B环有部分双键；17位有不同的测链。,目前甾体微
2、生物转化中受到人们广泛关注的领域,将微生物基因工程的新技术应用于甾体微生物转化提高水不容性底物的溶解度细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利用发展经济有效的产物连续回收方式将环糊精等应用于培养基以提高产量,甾体化合物结构,甾体化合物编号,甾类化合物常见种类,动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等 睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。 植物中：薯芋皂豆甾醇 酵母细胞：麦角固醇,甾体化合物编号,甾类化合物常见种类,动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等 睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。 植物中：薯芋皂豆甾醇 酵母细胞：麦角固醇,甾体类激素药
3、,肾上腺皮脂激素类 可的松、强的松、氢化可的松 功能：抗炎、抗毒、抗过敏 对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗作用。生殖腺激素 孕酮、雌酮 功能：调节内分泌人工合成避孕药 长效孕酮等,微生物在甾体药物生产中的应用,主要分为两大类将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。 如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基 降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体， 雄甾4烯3，17二酮； 雄甾1，4二烯3，17二酮。转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所需要的产物。 如：甾体11，11及16羟化， 1 脱氢 甾体边链降解,微生物对甾体化合物的转化,微生物对甾体化合物的转化多种多样它们对甾体的每一位置上的
4、原子或基团都有可能进行生物转化。其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、形成内酯、侧链断裂、降解。,羟基化反应,是甾体微生物转化中最重要的反应。化学法除了较容易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入羟基。,微生物对甾体的羟基化作用,微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应，也可在非甾类有机分子上羟基化。简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入O原子。在甾核上至少有21个位置可以发生。11位羟基化作用最重要，11位C的氧化对可的松药物疗效是不可缺少的，11，11。除11位C进行羟基化反应外，9，14，16的
5、羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾类化合物及其类似物。,进行甾体羟基化作用的微生物,羟基化反应机理,羟基化反应,由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因此被定义位单氧化酶。这种细胞色素p450依赖的单氧化酶存在于几乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的形式存在。,同位素实验证明,甾体羟基化中存在的问题,环糊精的生理作用,Hesselink等研究： 应用环糊于分枝杆菌甾体边链的降解。环糊精是一种环状寡聚糖，一般由68个葡萄糖分子通过1，4糖苷键连接而成。易溶于水。含有疏水性空腔，可与疏水性分子结合。可作为几种甾体类药物的稳定剂和增溶剂。,环糊精的应用实例1,Chincholkar 等研究了在环糊
6、精存在时，Currularia VKMF-644对11脱氢皮甾醇（Reichstein S化合物，简称化合物S）的11羟基化。在底物浓度为4g/L时：化合物S： CD1.0:0.6 氢化可的松的产率为7075无CD： 氢化可的松的产率为4050,环糊精的应用实例2,GD：19去甲基13乙基雄甾4烯3，17双酮 经Penicillium raistrickii进行15羟基化口服避孕药5D十八甲基炔诺酮（gestodene）的重要中间体。Schlosser等研究表明：在环糊精存在时，菌株或其固定化细胞对CD的15羟基化作用，与以甲醇做溶剂比较，其转化率都能明显提高。,环糊精作用,环糊精有利于提高甾
7、体底物溶解度真菌能以环糊精作为C源,其他重要的羟基化反应,地索高诺酮（destogestrel） 新型避孕药（荷兰Organon公司推出） 作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠我国研究：上海医科大学史纪平19去甲基13乙基雄甾4烯3，17双酮11羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键中间体简化合成路线，降低副反应。底物：0.2% 转化率：36,甾体的边链降解,侧链降解,微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用原价的原料开辟了新的途径。常见微生物有：简单节杆菌球形芽孢杆菌玫瑰芽孢杆菌淡紫青霉藤黄诺卡氏菌,甾体边链降解甾体母核降解,3羟基5甾醇,9羟基化，1，2脱氢
8、,甾体边链降解,采用类似脂肪酸氧化的氧化过程，最后形成C17酮甾体。,选择性边链降解问题,选择性边链降解策略（3） 辅助基因工程提高边链降解的产率策略,选择性甾体边链降解措施1,对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降解 例如：1965 Sih等 将胆固醇先行改造为19羟基衍生物 再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮。,选择性甾体边链降解措施2,加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C 1，2脱氢酶和9羟化酶。 如： Ni Co Pb Se 8羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选性边链降解 金属鳌合剂 2，2双联吡啶 抑制母核降解,选择性甾体边链降解措施3,对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链
9、的突变株例如：原始菌株经诱变为 诱变菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683 不加抑制剂，便产生雄甾1，4二烯3，17二酮（ADD）再诱变得Mycobacterium sp，NRRL-B3805， 无C 1，2脱氢酶 能产生雄甾4烯3，17二酮（AD）,基因工程新技术的应用,专利： Pseudomonas 菌株无降解甾体的能力将Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA导入Pseudomonas 菌株中获得重组菌。重组菌可在水相，一种或几种有机相中进行转化反应。Pseudomonas 菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生长输率快结
10、果加快转化进程，降低成本。,方法,分离纯化Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA整合到特定质粒载体中导入噬菌体中用入噬菌体感染E.coli HB101，得E.coli重组子三亲杂交实现Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA到Pseudomonas 菌株得转移。,如何提高甾体边链降解的产率,接触,提高甾体边链降解速率,Hesselink等研究表明：环糊精能明显增强Mycobacterium sp NRRL-3683 降解胆固醇、谷甾醇等边链生成AD的产率，不影响细胞生长速度和细胞密度。当环糊精：底物浓度=2:1时，微生物降解边链的活性可增加1.7-
11、3.0倍。环糊精能阻止母核的降解及产物的反馈抑制。,环糊精在甾体边链降解中的作用总结,在甾体边链降解过程中，环糊精充当： 惰性甾体增溶剂反应载体保护剂,甾体边链降的成功应用,Arhna 和Sih等研究报道以胆甾醇和谷甾醇为原料微生物转化法合成甾体药物中间体的方法。采用酶抑制剂生化阻断变株改变细胞膜通透性等生物技术改造甾醇的结构，从而选择性控制甾醇的边链降解成功合成中间体 雄甾4烯3，17二酮（4 AD） 雄甾1，4二烯3，17二酮（ADD） 9羟基4AD目的：工业生产性激素，利尿剂等甾体药物,其他的甾体生物转化反应类型,脱氢作用A环芳香,脱氢作用使甾体核形成双键,强的松（去氢可的松） 是可的松
12、经脱氢而形成的。 其抗炎功效比可的松高几倍。一般制备该种药物时，常常是将可的松或氢化可的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化可的松。,脱氢反应的常见微生物为,简单节杆菌 各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌） 镰刀霉 长蠕孢菌属。,A环芳香化,所谓A环芳香化 是指甾体A环核上的每个C原子都脱氢形成双键，而变为芳香化结构。 雌性激素的生产（雌二醇），可通过此方法获得,研究生物转化的几种常用方法,第四章 研究生物转化的几种常用方法,间歇培养法整体细胞转化法洗涤均丝悬浮法（静息细胞法）孢子转化法原生质体实验法遗传特性诱变法同位素示踪法,间歇培养法（Batch culture),这种方法能够比较直接而简
13、单地筛选能否具有转化某种化合物的活性菌株。,游离的整体细胞,游离的整体细胞直接作为催化剂来制造产品的报道已经不少在某种程度优于固定化细胞在生物转化酶工程中越来越受到重视游离整体细胞的基础研究更为重要,游离整体细胞的基础研究内容,细胞的渗透化酶的胞内固定化酶细胞在反应前后的形态变化和结构变化,整体细胞转化应用举例,底物：富马酸产物L天冬氨酸生物转化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）转化菌株：E.coli,整体细胞转化研究,培养基,培养方法,不同底物浓度的反应速率,底物质量浓度较高时，在某一时间（8h）前，转化速率较低，而后，反应速度加快。 对底物富马酸盐的转化彻底。（99.2）底物浓度较低时，
14、反应速度始终较慢 对底物富马酸盐的转化不彻底。（63）特点：高质量底物浓度有较高的反应速率高质量浓度底物有较高的转化率催化反应一般有个迟滞期,酶细胞在生物转化中的形态变化低底物浓度扫描观察,酶细胞在生物转化中的形态变化高底物浓度扫描观察,形态学变化,高质量底物浓度下细胞发生明显的形态学变化 细胞表面发上皱褶，有明显的凹陷 细胞膜变薄，松弛、不明显，内部结构变松，不致密。,高质量浓度底物对含酶细胞的渗透化作用,静息细胞法,为了排除原培养基中自身的代谢产物对不同生长阶段转化的影响，常常用洗涤的静息细胞来代替发酵液中的生长的细胞，即将不同生长阶段的细胞取出，洗去沾染的原培养液及其代谢产物，然后把细胞
15、悬浮在人工转化系统内，在一定条件 下进行生物转化。,孢子转化法,真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶活力高，且常常用于生物转化。 细菌的内生孢子（芽孢），一般无转化活性。,转化方法,相似于静息细胞法。 不采用完全培养基，只选用缓冲液或含有葡萄糖一类能源的物质即可。 通常转化时使用的孢子浓度为108109个/ml. 转化pH一般为5-6,原生质体试验法,方法 通过溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等脱去细胞壁，获得原生质体。 将原生质体悬浮于高渗稳定液中，添加前体物质，进行喂养试验，观察结果。,原生质体试验法特点,排除了细胞壁通透性障碍。保全了整体细胞的内酶系统。避免了无细胞抽提法中，用破碎细胞而损坏了
16、酶体系，从而使某些需要偶联的酶反应（氧化还原反应）不能进行的缺点。,遗传特性诱变法,菌种诱变不仅是提高产量的重要手段，而且也是研究生物转化过程中，产物形成的遗传机制的一种有效方法。将转化菌进行诱变，使其失去转化底物或形成某个中间体的能力，从而就可分离到生物转化中的各种不同的障碍突变株，即负突变株。这种负突变株能够积累某种代谢产物或支路代谢产物。从分析转化菌和突变株的代谢产物化学结构上的 差异，找出这些代谢产物在合成中的相互关系，从而可推断生物转化的反应步骤。,同位素示踪法,同位素示踪法是研究生物转化的好方法。即应用同位素转化的起始物和中间体进行喂养试验，由于试验菌没有区别标记化合物及非标记化合
17、物的能力，因此标记化合物和非标记化合物一样，都能参与菌体的代谢变化，然后通过测定产物或中间体的同位素含量及分布情况，从而判断试验化合物是否参与生物转化。缺点为了确定同位素的结合位置，必须将产物进行一系列的化学降解、分离和测定等大量工作。,近年研究概况,近年来，利用没有放射性的稳定同位素13C、2H、15N、18O等来作示踪研究，特别是13C，可应用碳核磁共振仪来直接测定该生物转化产物中间体的碳核磁共振谱，从核磁共振谱的解析中，便可知道该示踪原子被结合到产物或中间体的分子结构中的位置和分布情况。由于这项工作可在实验室完成，不仅简化了大量的化学降解和分析测定步骤，而且保证工作人员的健康和推进研究工作的进展。,
