1、毕业论文开题报告食品科学与工程抗氧化活性乳酸菌的筛选及其遗传稳定性研究一、选题的背景与意义氧化反应是许多生物产生能量的必要反应。然而，过多的氧化反应也会破坏生物大分子。尽管人类和其它生物具有的抗氧化防御系统能保护他们免于氧化损伤,但这些系统对于防止氧化损伤并不能完全有效地发挥其作用。近年来证实，抗氧化剂可以被用来帮助人体减少氧化损伤，但是,合成抗氧化剂对健康和长期效应等存在安全的问题。寻找天然的安全的抗氧化剂将成为研究热点。乳酸菌广泛应用于食品工业，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，增加食品贮藏期，而且具有特殊的营养价值和生理活性。大量研究表明，乳酸菌可以调节机体肠胃道正常菌群，抑制肠
2、道内腐败菌生长繁殖产物的产生，保持微生态平衡，促进免疫能力，还具有降低血脂胆固醇，抗肿瘤、防癌等功能，从而对机体的生理功能、免疫反应、肿瘤发生和衰老过程等产生全面的营养保健作用。因此，筛选具有抗氧化活性的乳酸菌具有很大的研究和应用价值。我国的发酵乳制品行业发展的十分迅速，但是由于在这方面的研究较少，还是出现了许多问题，例如我国保藏的发酵剂菌种大部分从国外的发酵剂中分离，对其在遗传中的稳定性并不了解，这方面的研究也甚少。要想真正发展我国的发酵乳制品行业，这个问题是需要被重视的。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题以20种实验室保藏菌种为来源，从中筛选出具有抗氧化活性的乳酸菌，通过电泳的方法，分析
3、抗氧化活性乳酸菌全菌体蛋白在传代遗传过程中的表达差异，来判断其在遗传过程中的稳定性。1利用乳酸菌清除DPPH自由基和超氧自由基的试验，从中筛选出具有较好抗氧化活性的乳酸菌。2通过传代培养，提取全菌体蛋白，利用SDSPAGE电泳的方法，找出全菌体蛋白在遗传过程中的表达差异，进一步研究乳酸菌的遗传稳定性。三、研究的方法与技术路线技术路线研究方法抗氧化活性乳酸菌的筛选乳酸菌无细胞提取物的制备乳酸菌培养采用液体MARS培养基，37摇床培养箱中培养24H。取培养液300ML，在5000R/MIN下离心20分钟，去上清液去菌体，加入30MLPBS磷酸缓冲液，在5000R/MIN下离心20分钟，去上清液去沉
4、淀，再加入30ML的PBS磷酸缓冲液，在5000R/MIN下离心20分钟，去上清液，取沉淀，加去离子水30ML，经冰浴超声破碎细胞后，在4，12000R/MIN离心20MIN，收集上清液，即为无细胞提取物。乳酸菌清除自由基DPPH的能力测定取不同样品20ML，加入40ML（浓度为01MMOL/L）的DPPH乙醇溶液和10ML（浓度为50）的乙醇溶液，混合均匀后，在暗处反应40分钟，并在10000R/MIN下离心20MIN，弃沉淀取上清液，在517NM下测定吸光度AI。空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并且空白组空白调零。清除率（AIAJ）/AI乳酸菌清除超氧自由基的能力测定取不同样品10ML，
5、分别加入45ML（浓度为01MOL/L，PH为82）的TRISHCL溶液，10ML（浓度为1MMOL/L）的EDTA溶液，24ML的纯水和20ML（浓度为9MMOL/L）的邻苯三酚溶液，混合均匀，反应40MIN后，分别加入100L的HCL溶液（浓度为12MOL/L），并在10000R/MIN下离心20MIN，弃沉淀取上清液，在325NM下测定吸光度AI空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并且空白组空白调零。清除率（AIAJ）/AI抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性传代培养在200ML灭菌过的三角瓶中加入150MLMRS培养基，接种筛选出的具有抗氧化活性的乳酸菌15ML，即接种量为1，置于37的恒温培养
6、箱中培养。培养24H后，取该发酵液15ML，接种到装有150MLMRS培养基的200ML灭菌过的三角瓶中（接种量为1），此为第1代，如此连续接种20天。菌体蛋白的制备抗氧化活性乳酸菌的筛选乳酸菌清除自由基DPPH能力的测定乳酸菌清除超氧自由基的能力测定抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性传代培养菌体蛋白的制备SDSPAGE电泳分别取第1代、第5代、第10代、第15代和第20代的乳酸菌菌液适量，在4000R/MIN下离心20MIN，弃上清液，加PBS磷酸缓冲液清洗，在4000R/MIN下离心20MIN，弃上清液，反复清洗2次，在菌体沉淀中加入无菌水，制成悬菌液，用超声波破碎乳酸菌（用作时间10S，间隔时
7、间10S，破碎20分钟，破碎功率为400W），取破碎后的菌体，在4000R/MIN下离心20MIN，取上清液，即为菌体蛋白。SDSPAGE电泳（不连续电泳）将分离胶（由PH88的分离胶缓冲液配制）灌入两块玻璃板之间,放置约30MIN，待凝聚后将上层水去尽吸干，然后在分离胶上倒入浓缩胶（由PH68的分离胶缓冲液配制），灌满，稍后插入样品梳。待浓缩胶凝聚后，在上下贮槽中倒入电泳缓冲液，取出样品梳，用微量注射器吸取10L样品至凹形凝胶样品槽。开始电泳时，当样品在浓缩胶时的电压为120V，电流改为20MA，当样品进入分离胶后，电压改为180V，电流改为30MA。结束电泳后，将凝胶板放在培养皿内，加固定
8、液，作用10MIN后，倒去固定液，加入染色液，染色1H左右，用蒸馏水漂洗数次后，再用脱色液脱色，第一次脱色20MIN，第二次脱色2H，知道蛋白质区带清晰即可。四、研究的总体安排与进度主要内容进度专业知识建立2010年9月到2011年11月乳酸菌的生理功能乳酸菌的抗氧化作用实验步骤设计2010年11月到2011年2月筛选具有抗氧化活性乳酸菌研究抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性结果分析2011年2月到2011年3月完成论文2011年3月到2011年4月五、主要参考文献1杨洁彬,郭兴华乳酸菌生物学基础及应用M北京中国轻工业出版社，19962赵保路氧自由基和天然抗氧化剂M北京科学出版社，19993CHEN
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