1、慢性乙肝实验室检测及临床意义,刘怀祥重庆骑士医院肝病科 贡献,1 血清酶检测 血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase， ALT）：是目前临床上反映肝细胞功能的最常用指标。急性肝炎时ALT明显升高，黄疸出现后ALT开始下降；慢性肝炎和肝硬化时ALT轻度或中度升高或反复异常；重型肝炎患者可出现ALT快速下降，胆红素不断升高的酶、胆分离现象，提示肝细胞大量坏死。,1 血清酶检测 天门冬氨酸转氨酶(asparate aminotransferase，AST) ：特异性较ALT低。此酶在心肌含量最高，依次为肝、骨骼肌、肾、胰。在肝病时血清AST升高，当病变持久且较严重时，线粒
2、体中AST释放入血流，其值可明显升高。急性肝炎时如果AST持续在高水平，有转为慢性肝炎的可能。,AST/ALT： 急性肝炎时AST/ALT常小于1，慢性肝炎和肝硬化时AST/ALT常大于1。比值越高，则预后愈差，病程中AST/ALT比值降低，提示未损及肝细胞线粒体，预后较佳。,碱性磷酸酶：当肝内或肝外胆汁排泄 受阻时，血清ALP活性升高。 谷氨酰转肽酶：肝炎和肝癌患者可 显著升高，在胆管阻塞的情况下更明显，-GT活性变化与肝脏病理改变有良好的一致性。 乳酸脱氢酶：肝病时可显著升高。 胆碱酯酶：其活性降低提示肝细胞已有较明显损伤，其值愈低，提示病情愈重。,2 血清蛋白： 主要由白蛋白（A），1，
3、2，及球蛋白组成。前4种主要由肝细胞合成，球蛋白主要由浆细胞合成。在急性肝炎时，由于白蛋白半衰期较长，约21天，以及肝脏的代偿功能，血清蛋白质和量可在正常范围内。慢性肝炎中度以上、肝硬化、重型肝炎时出现白蛋白下降，球蛋白升高，白/球（A/G）比例下降甚至倒置。,3 胆红素： 急性或慢性黄疸型肝炎时血清胆红素升高，活动性肝硬化时亦可升高且消退缓慢，重型肝炎常超过171mol/L。一般情况下，肝损程度与胆红素含量呈正相关。直接胆红素在总胆红素中的比例尚可反映淤胆的程度。,4 凝血酶原活动度（PTA）： PTA高低与肝损程度成反比。PTA40是诊断重型肝炎的重要依据，PTA亦是判断重型肝炎预后的敏感
4、指标。 对照-(对照 0.6) PTA= 100% 样本-(对照 0.6),5 血氨： 肝衰竭时清除氨的能力减退或丧失，导致血氨升高，常见于重型肝炎，肝性脑病患者。,6 血常规： 急性肝炎时白细胞稍低或正常，淋巴细胞相对增多，偶可见异型淋巴细胞。重型肝炎时白细胞可升高，红细胞下降，血红蛋白下降。肝炎肝硬化伴脾功能亢进者可有血小板、红细胞、白细胞减少的“三少”现象。,7 尿常规： 尿胆红素和尿胆原的检测是早期发现肝炎的简易有效方法，同时有助于黄疸的鉴别诊断。肝细胞性黄疸时两者均阳性，溶血性黄疸时以尿胆原为主，梗阻性黄疸以尿胆红素为主。妊娠急性脂肪肝患者尿胆红素常阴性，有助于与妊娠急重型肝炎鉴别。
5、,8 电解质 重型肝炎常见低K+、低Na+，低Cl-，亦可有低Ca2+、低Mg2+、低P2- 等。肝肾综合征时可出现高K+。,9 血糖 超过40重型肝炎患者有血糖降低，临床上应注意低血糖昏迷与肝性脑病的鉴别。,10 血浆胆固醇 60-80的血浆胆固醇来自肝脏，肝细胞严重损伤时，胆固醇在肝内合成减少，故血浆胆固醇明显下降，胆固醇愈低，预后愈险恶。梗阻性黄疸时胆固醇升高。,11 补体 当肝细胞严重损害时，补体合成减少。临床检测CH50和C3补体对预后有评估作用。,12 甲胎蛋白（AFP） HBV和HCV感染与肝细胞癌（HCC）的发生有明显相关性，AFP含量的检测是筛选和早期诊断HCC的常规方法。肝
6、炎活动和肝细胞修复时AFP有不同程度的升高。应进行动态观察。急性重型肝炎AFP升时，提示有肝细胞再生，为预后良好的标志。,13 胆汁酸 血清中胆汁酸含量很低，当肝炎活动时胆汁酸升高。由于肝脏对胆红素和胆汁酸的运转系统不同，检测胆汁酸有助于鉴别胆汁淤积和高胆红素血症。,14 肝纤维化指标 一些检测项目已在临床上应用，如型前胶原肽、型胶原，层连蛋白、透明质酸、脯氨酰羟化酶等，对肝纤维化的诊断有一定参考价值，但缺乏特异性。,15 影像学检查 B型超声波有助于鉴别阻塞性黄疸、脂肪肝及肝内占位性病变。对肝硬化有较高的诊断价值，能够反映肝脏表面变化，门静脉、脑静脉直径，脾脏大小，胆囊异常变化，腹水等。彩色
7、超声波尚未可观察到血流速度。在重性肝炎中可动态观察肝脏大小变化等，CT的应用价值基本同B型超声波，但其有损伤性和价值昂贵，如应用增强剂，可加重病情。,16 肝活检病理检查 其意义包括对病毒性肝炎作出病理诊断，对不典型病例作出明确判断，有助于治疗效果评价及观察预后转归，还可从组织中检测病原标志以明确感染。,17 病原学检查,HBV基 因 及 编 码 蛋 白,乙型肝炎,HBsAg与抗HBs HBsAg在感染HBV两周后即可阳性。只要HBsAg阳性就可诊断HBV感染，阴性则不能排除HBV感染。 抗HBs为保护性抗体，阳性表示对HBV有免疫力。低滴度应注意假阳性。,乙型肝炎,HBsAg与抗HBs HB
8、V感染后可出现HBsAg和抗HBs同时阴性，即所谓窗口期，此时HBsAg已消失，抗HBs仍未产生，少部分病例始终不产生抗HBs。 HBsAg和抗HBs同时阳性可出现在HBV感染恢复期，此时HBsAg未消失，抗HBs已产生；另一情形是S基因区发生变异，野生株抗HBs不能将其清除；或抗HBs阳性者感染了免疫逃避株,HBsAg,常用ELISA法检测。目前HBsAg诊断试剂质量较高， 灵敏度可达0.2ng/L。从全国 室间质控评价结果显示，阳 性标本检出率达到或超过98。 HBsAg滴度越高，HBeAg、 HBV DNA阳性的可能性越大。 血液与肝组织的HBsAg含量并不完 全相关,HBsAg阳性就可
9、诊断HBV现症感染吗？,为什么血清HBsAg阴性不能排除HBV感染？ 检测试剂不够敏感。 Abbott试剂盒由ad亚型抗体和抗原制备， 对ay亚型的灵敏度较低。 S基因变异（抗原性发生改变）。 X基因变异（转录受抑制）。 重叠HCV感染（干扰HBsAg合成）。,HBsAg抗原性aa124-147 HBsAg共同决定簇“a”aa122 确定HBsAg亚型d/y， 赖氨酸/精氨酸aa160 确定HBsAg亚型w/r， 赖氨酸/精氨酸,能导致HBsAg阴性的S区变异 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 苏氨酸 天冬氨酸 aa131 蛋氨酸 苏氨酸 aa122-12
10、4 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失,如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染？ 提高检测敏感性 采用针对变异抗原的检测试剂 HBV DNA的检测 组织中标志物的检测,提高检测HBsAg敏感性方法 Aoki基于电子旋转共振技术的HBsAg EIA方法，检测HBsAg中稳定的氮氧基因。在30例HBsAg阴性样本中，检出11例阳性。,抗HBs阳性就万无一失了吗？低滴度应注意假阳性 单一抗HBs阳性HBV DNA检出率0-11.8%： 先后感染了不同的HBV亚型 S基因变异 X基因变异,抗HBs阳性HBV DNA阴性并不排除肝细胞内HBV的存在,HBsAg与抗HBs共存 可出现在HBV感染的恢复期，此
11、时 HBsAg未消失，抗HBs已产生，大部 分归功于检测敏感性的提高。 S基因发生变异，野生株抗HBs不能将 其清除； 抗HBs阳性者感染了不同亚型HBV或 免疫逃避株。,基因变异导致HBsAg与抗HBs共存 aa126 苏氨酸 丝、异亮氨酸 aa141 赖氨酸 谷氨酸 aa145 甘氨酸 精氨酸 前S1 nt3025-3154缺失,乙型肝炎,HBeAg与抗HBe HBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的传染性。HBeAg消失而抗HBe产生称为血清转换。抗HBe阳转后，病毒复制多处于静止状态，传染性降低。长期抗HBe阳性者并不代表病毒复制停止或无传染性，研究显示20%50%仍可检测到HBV
12、DNA，部分可能由于前C区基因变异，导致不能形成HBeAg。,HBeAg 是重要的免疫耐受因子，大部分情 况下其存在表示患者处于高感染低 应答期。 HBeAg与HBV DNA有良好的相关 性。 阳性标本检出率90左右。,HBeAg水平与HBV DNA的关系 HBeAg 134PEIU/L, HBV DNA 6.931.03e。 HBeAg 0.28134PEIU/L, HBV DNA 5.581.84e 。,HBeAg阴性/抗HBe阳性，HBV DNA阳性HBV感染是否均由前C区变异导致？,HBeAg阴性/抗HBe阳性，HBV DNA阳性 基因变异 HBV低水平复制 重叠HCV感染。,基因变异
13、导致HBeAg阴性/抗HBe阳性，HBV DNA阳性HBV感染 前C区1896位G A，形成终止密码， HBeAg合成终止。 前C区缺失或插入变异，改变HBeAg 的抗原性，常规试剂检测阴性。 C区变异，导致HBeAg的抗原性改变。 C基因启动子点突变或起始密码点突变。 X区变异使mRNA转录受抑制，导致 HBeAg合成减少，甚至难以检出。,HBeAg阴性/抗HBe阳性，HBV DNA阳性HBV感染 HBV DNA水平一般较低。 90%以上由于nt1896位突变引起。 多发生于D型HBV。,HBeAg与抗HBe共存 血清转换过程中。 检测敏感性提高。 野生株与变异株同时存在。,乙型肝炎,HBc
14、Ag与抗HBc HBcAg阳性表示血清中存在Dane颗粒，HBV处于复制状态，有传染性。抗HBc IgM是HBV感染后较早出现的抗体，绝大多数出现在发病第一周，多数在6个月内消失。高滴度的抗HBc IgM对诊断急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎急性发作有帮助。单一抗HBc IgG阳性者可以是过去感染，因其可长期存在；亦可以是低水平感染，特别是高滴度者。,抗HBc阴性的HBV感染 免疫耐受。 检测试剂原因，目前试剂准确性 约85%。 C区突变。,检测HBV-M水平有无意义？ HBsAg水平与HBeAg及HBV DNA 。 抗HBs水平与是否注射疫苗。 HBeAg水平与HBV DNA。 与抗病毒治疗。 抗
15、HBc水平与现症感染。,血液中HBV-M水平是否与肝组织中HBV-M水平成正比关系？,乙型肝炎,HBV DNA 病毒复制和传染性的直接标志。HBV DNA定量对于判断病毒复制程度，传染性大小，病毒药物疗效等有重要意义。HBV DNA检测方面，还有前C区变异、S区变异和多聚酶基因YMDD变异等检测。,HBV DNA拷贝数乙肝病毒载量,为什么建议每个病人都要进行HBV DNA检测？,HBV DNA检测的临床意义 诊断方面： HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志,HBV DNA检测的临床意义, 对HBV-M起补充作用： HBe
16、Ag()/ 抗HBe()乙型肝炎 （前C区变异） HBsAg()乙型肝炎 （S区变异） 低水平感染 单项抗HBc()乙型肝炎,HBV DNA检测的临床意义, 疗效判断： HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 预后判断 HBV DNA水平与病情有一定的关系,HBV DNA检测的临床意义,调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。,HBV DNA检测方法, 斑点杂交（基本淘汰） 定性PCR（基本淘汰） 定量PCR（主流） 基因芯片
17、（将来）,HBV DNA检测方法的比较,斑点杂交 PCR 定量PCR敏感性 105 102 102特异性 高 稍低 高重复性 好 稍差 好定量范围 4 6 6简便 较繁琐 简便 简便安全性 好 好 好设备 便宜 稍贵 昂贵技术要求 低 高 高检测价格 低 中 高,基因芯片与HBV DNA定量检测HBV结果比较 基因芯片 阳性 阴性 阳性 19 4HBV DNA定量 阴性 2 15 符合率为85%(34/40)，芯片检出率为82.61%(19/23), 假阳性率为11.76%(2/17).,基因芯片与HCV RNA定量检测HCV结果比较 基因芯片 阳性 阴性 阳性 7 5HCV RNA定量 阴性
18、 1 27 符合率为85%(34/40)，芯片检出率为58.33%(7/12), 假阳性率为3.57%(1/28)。,基因芯片与错配PCR检测YMDD变异株结果比较 基因芯片 阴性 YMDD YVDD YIDD 混合 错 阴性 3 0 0 0 0配 YMDD 1 3 1 1 2PCR YVDD 1 2 5 0 0 YIDD 0 0 0 0 1 混合 0 0 0 0 0 5份芯片检测的标本与DNA序列测定结果一致,为什么建议每个病人都要进行HBV DNA检测？ 从HBV DNA与HBV-M的关系中可得到解答,我科1474例 HBV-M与HBV DNA结果分析 HBsAg HBeAg HBcAb
19、HBsAb HBeAb 例数 HBV DNA(+) 例数(%)1 + + + - - 603 520（86.2）2 + - + - + 465 163（35.1）3 + + - - - 19 18（94.2）4 + - + - - 216 88（40.7）5 + - - - + 5 3（60）6 - - + + + 20 1（5）7 - - + + - 27 1（3.7）8 - - + - + 24 2（8.0）9 - - - + + 1 0（0）10 - - - + - 56 2（3.6）11 - - + - - 26 3（11.5）12 + + + + - 2 2（100）13 - - -
20、 - - 10 0（0）合计 1474 803,HBV-M与HBV DNA关系 本科 四川 湖南 解放军 南方医院 “ 大三阳” 86.2 85.0 87.3 94.38 93.4“小三阳” 35.1 20.3 25.6 27.3 83.8“ 小二阳” 40.7 27.6 48.8 38.56 80.5 抗HBc 11.5 10.8 39.3 抗HBs 3.6 0 9.7 0 三抗体阳 5.0 1.1 10.0 全阴 0 4.0调查总例数 1474 2828 814 838 773HBV DNA阳性率,HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性可能有以下原因： (1) 干扰素或拉米夫定等
21、治疗后病毒复制 受抑制。 (2) PCR所用引物相应的DNA序列发生 突变，此引物与突变DNA不能配对结 合。 (3) 病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而 血中游离HBV DNA很少或缺乏。,乙型肝炎,组织中HBV标志物的检测 可用免疫组织化学方法检测肝组织中HBsAg、HBeAg的存在及分布；原位杂交或原位PCR方法检测组织中HBV DNA的存在及分布。除可判定病毒是否处于复制状态外，对血清中HBV标志物阴性病人的诊断有一定意义。,有关YMDD变异株的检测,YMDD变异,YMDD 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸。如发生YMDD变异，则其中的蛋氨酸（M）突变为异亮氨酸（isoleucine，
22、I）或缬氨酸（valine，V）形成YIDD变异株或YVDD变异株 。YMDD位于HBV多聚酶的关键功能区。,有关YMDD变异株的检测 拉米夫定治疗后HBV DNA复阳是否均由YMDD变异引起？ 如果是，不用检测YMDD，只需检测HBV DNA即可。,有关YMDD变异株的检测,我科7例出现耐药性的患者中，6例发现有YMDD变异。提示耐药性的发生主要是由于YMDD变异所造成，但可能存在YMDD变异以外的其他因素。,有关YMDD变异株的检测 Alleb报道20例拉米夫定治疗后耐药病例，所有均存在YMDD变异。 Gane报道8例拉米夫定治疗后耐药病例，所有均存在YMDD变异。,有关YMDD变异株的检
23、测,自然条件下存在YMDD变异株。我科发现一例。Kobayashi报道18例ALT正常HBV无症状感染者中，5例拉米夫定治疗前为YMDD变异株。,有关YMDD变异株的检测,既然自然条件下存在YMDD变异株，拉米夫定治疗前是否应进行YMDD变异株的检测？,有关YMDD变异株的检测,YIDD可能是YMDD 突变为YVDD的中间产物，是否意味着检测时应区分YIDD变异株还是YVDD变异株？,甲型肝炎 抗HAV IgM：在发病后数天即可阳性，36月转阴。是早期诊断甲型肝炎最简便而可靠的血清学标志。 抗HAV IgG：出现稍晚，于23个月达到高峰，持续多年或终身。抗HAV IgG阳性表示受过HAV感染。
24、属于保护性抗体，具有免疫力的标志。,丙型肝炎,抗HCV IgM和抗HCV IgG：HCV抗体不是保护性抗体，是存在HCV感染的标志。抗HCV IgM在发病后即可检测到，一般持续13个月。如果抗HCV IgM持续阳性，提示病毒持续复制，易转为慢性。低滴度抗HCV IgG提示病毒处于静止状态，高滴度提示病毒复制活跃。,丙型肝炎,HCV RNA HCV RNA阳性是病毒感染和复制的直接标志。HCV RNA亦可定量，定量测定有助于了解病毒复制程度、抗病毒治疗的选择及疗效评估等。,有关丙型肝炎的病原检测,为什么要同时检测抗HCV及HCV RNA？ 抗病毒治疗的要求。 防止漏诊。,有关丙型肝炎的病原检测,
25、有报道223例丙型肝炎病例中，抗HCV和HCV RNA同时阳性86例，单纯抗HCV阳性118例，单纯HCV RNA 阳性19例。 表明单做其中一项可能导致漏诊。,丁型肝炎,HDAg、抗HD IgM及抗HD IgG HDAg阳性是诊断急性HDV感染的直接证据。HDAg在病程早期出现，持续时间平均为21天。 抗HD IgM阳性是现症感染的标志，当感染处于HDAg和抗HD IgG之间的窗口期时，可仅有抗HD IgM阳性。 抗HD IgG亦非保护性抗体，高滴度提示感染的持续存在，低滴度提示感染静止或终止。,有关丁型肝炎的病原检测,为什么丁肝三项一般不会同时阳性？,有关丁型肝炎的病原检测,HDAg在病程
26、早期出现，持续时间平均为21天，有相当一部分患者在急性期仅有HDAg，无抗HD存在，随着抗HD的产生，HDAg多以免疫复合物形式存在，此时检测HDAg为阴性。在慢性HDV感染中，由于有高滴度的抗HD，HDAg多为阴性。当感染处于HDAg和抗HD IgG之间的窗口期时，可仅有抗HD IgM阳性。,有关戊型肝炎的病原检测,抗HEV IgM在发病初期产生，大多数在3个月内阴转。因此，阳性是近期HEV感染的标志。,有关戊型肝炎的病原检测,感染HEV两周后，97.8%病例抗HEV IgG阳性，1年后有28.1%病例仍为阳性，但滴度下降。,有关戊型肝炎的病原检测,为什么有必要进行抗HEV IgG滴度的检测？,有关戊型肝炎的病原检测,目前较为一致的看法是抗HEV IgG在急性期滴度较高，恢复期则明显下降。因此，如果抗HEV IgG滴度较高，或由阴性转为阳性，或由低滴度升为高滴度，或由高滴度降至低滴度甚至阴转，均可诊断为HEV感染。,有关戊型肝炎的病原检测,少数戊型肝炎病人始终不产生抗HEV IgM和抗HEV IgG，两者均阴性时不能完全排除戊型肝炎。,谢谢！,
