1、毕业论文开题报告水产养殖大黄鱼冷冻精子细胞结构损伤的研究一、选题的背景与意义鱼类精子的冷冻保存研究和探索，不仅对进一步分析生命的进程具有重要意义，而且对鱼类新品种的培育和养殖业的发展也具有促进作用。美国学者对哥伦比亚河某些濒危灭绝的鲑鱼和鲟鱼进行了精子冷冻保存，建立起了基因库；我国长江水产研究所建立了包括“四大家鱼”在内的淡水鱼类精子库；海洋鱼类，如黑鲷、真鲷、花鲈、牙鲆等的精子冷冻也取得了较大的进展。鱼类精子超低温冻存是鱼类种质资源保存，尤其是濒危、珍稀鱼类的种质资源保存的有效途径之一，同时也能为育种提供种质材料。大黄鱼是我国名贵的海产经济鱼类，是传统“四大海产”之一，又是我国东南沿海重要的
2、海水养殖品种。目前大黄鱼存在着天然资源严重衰退、养殖品种种质退化等问题，大黄鱼精子冷冻保存技术研究，对于大黄鱼种质资源的保存及育种具有现实意义。大黄鱼精子冷冻在国内外已见相关报道，对大黄鱼精子冷冻与解冻后活力、受精率等有过详细介绍，然而对于冷冻过程中对大黄鱼精子细胞的结构损伤的详细研究却较为少见，存在着各种各样的因素使得冻存精子受到不同损伤，从而影响冻精质量，进而影响冻精的的活力、受精率以及应用价值等。大黄鱼冷冻精子细胞结构损伤的研究有助于我们评价冻精质量，改进与优化冻存技术与工艺，提高冻存效果。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1研究的基本内容（1）大黄鱼精子的超低温冻存（2）冷冻大黄鱼精
3、子细胞结构损伤，包括细胞膜、核膜、线粒体、轴丝或鞭毛结构损伤等。2拟解决的主要问题大黄鱼冷冻精子细胞结构损伤程度与抗冻剂浓度的相关性。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1采精在生殖季节，挑选合适的雄鱼并取其精液。要求选择体长2635CM，体重320525，2龄以上性腺发育成熟的雄鱼供采精用。2抗冻液配制抗冻液由稀释液加抗冻剂配置而成。稀释液为CORTLAND溶液（725克NACL，038克KCL，018克CACL2，100克NAHCO3，023克MGSO47H2O，041克NAH2PO42H2O，100克葡萄糖，用蒸馏水配置、定溶到1000毫升，调节PH值至700）。抗冻剂为二甲基亚砜（D
4、MSO）或甘油（GLY）。按稀释液抗冻剂867133的比例，配制抗冻液，放置于冰箱（4）保存备用。3冷冻保存将精液与抗冻液按13比例混匀，于4（置冰箱内）平衡1015分钟。之后将精液抗冻液混合物分装入体积为05毫升的麦细管中，每支盛约04毫升。将盛精麦细管平放于液氮面上几厘米处，几分钟后，将盛精麦细管投入液氮中，几分钟后，将液氮中的盛精细管转移到液氮罐中保存。4冻精的解冻可采用水浴快速解冻或自然解冻。5解冻后精子细胞结构损伤的检测将解冻后的精子与鲜精用25的戊二醛固定12H（4），然后用1锇酸后固定12H（4），乙醇梯度浓度脱水，SPURR氏环氧树脂渗透、包埋，LKB型超薄切片机切片，醋酸双氧
5、铀染色40MIN后水洗，再用柠檬酸铅染色1MIN后，在JEM1200EX型透射电镜下观察精子细胞结构损伤情况，并拍照。6结果分析根据实验结果分析冻精细胞结构损伤程度与抗冻剂浓度的相关性。二技术路线采集适合研究的大黄鱼精子配置抗冻液按精液与抗冻剂13混匀冷冻保存分装好冷冻保存对冻精进行解冻对解冻后精子细胞结构损伤进行检测分析结果五、主要参考文献1汪小峰，樊廷俊鱼类精子冷冻保存研究进展J青岛中国海洋大学生命学院海洋生物系20032CABNTAE,ALVARERANELETALSUBLETHALJCRYOBIOLOGY1998372452533RITARAJ，CAMPRTMSPERMSURVIVAL
6、DURINGSHORTTERMSTORAGEANDAFTERCRYPRESERVATIONOFSERNENFROMSTRIPEDTRUMPETERJTHERIOGENOLOGY，2000，54（3）3623644向祖琼,胡明广,曹文雷等两种冷冻保护剂对精子冷冻保护的效果比较J上海第二医科大学学报,2005,33183195RASULZ,AHMADN,ANZARMCHANGESINMOTIONCHARACTERISTICS,PLASMAMEMBRANEINTEGRITY,ANDACROSOMEMORPHOLOGYDURINGCRYOPRESERVATIONOFBUFFALOSPERMATOZOA
7、JANDROL,2001,2222782836徐大康细胞超低温的生物学问题J西北民族学院学报，1996，17（2）89907苏天凤、艾红鱼类精子活力及其超低温保存研究综述J上海水产大学学报,2004，13（4）3433478吴景贵鲤鱼精子的寿命观察报告J动物学杂志,1959，104624659四川省长江水产资源调查组长江鲟鱼类生物学及人工繁殖研究M成都四川科学出版社,198810谢刚，叶星，苏植蓬等鳗鲡精子的主要生物学特性J上海水产大学学报，1999，81818411鲁大椿，傅朝君，刘宪亭，等我国主要淡水养殖鱼类精液的生物学特性J淡水渔业，1989，192343712唐天德，许兴基，李文杰等几
8、个环境因子对梭鱼精子活力影响的初步研究J热带海洋，1985，42919713COSSONMP，BILLARDR，GATTIJL，ETALRAPIDANDQUANTITATIVEASSESSMENTOFTROUTSPERMATOZOAMOTILITYUSINGSTROBOSCOPYJAQUAC，1985，46717514陈松林,刘宪亭,鲁大椿等鲢、鲤、团头鲂和草鱼精液冷冻保存的研究J动物学报，1992,38441342415林丹军,尤永隆,陈炳英大黄鱼精子冷冻复苏后活力和超微结构变化J福建师范大学学报（自然科学版），2006，22（3）717616季相山，陈松林，赵燕等石鲽、牙鲆精子冷冻保存研究
9、及其在人工杂交中的应用J海洋水产研究，2005,26（1）131617郑跃平，刘鉴毅，谢从新等温度对中华鲟精子、卵子短期保存的影响J吉林农业大学报，2006,28668268618KOPEIKAJ,KOPEIKAE,ZHANGT,ETAL1EFFECTOFDNAREPAIRINHIBITOR3AMINOBENZAMIDEONGENETICSTABILITYOFIOACHMISGURNUSFOSSILISEMBRYOSDERIVEDFROMCRYOPRESERVEDSPERMJTHEIROGENOLOGY,2004,6191661167319黄巧珠、区又君、喻达辉等PH对4种鲷鱼精子活力的影响J
10、湛江海洋大学学报,1999，19（）141620柳凌，刘宪亭，章龙珍等鱼类、水生生物配子及胎盘在低温下保存研究进展J淡水渔业,1997，273131721黄晓荣,章龙珍,乔振国等抗冻剂对日本鳗鲡精子活力及运动时间的影响J海洋渔业,2007，29（3）19319922谭娟,张耀光,刘本祥等中华倒刺鲃、白甲鱼和岩原鲤精子的生理特性比较J淡水渔业,2006，36（6）3723赵钦,陈校辉,潘建林,黄颡鱼精子低温保存方法的初步研究及应用J水产科学,200827（12）61561824闫文罡,章龙珍,庄平日本黄姑鱼精子生理特性及超低温冷冻保存研究J海洋渔业,2008,30214515125黄晓荣,章龙珍,庄平等超低温冷冻对日本鳗鲡精子酶活性的影响J海洋渔业，200834（4）297302
