1、毕业论文开题报告水产养殖曼氏无针乌贼HSP70克隆及序列分析一、选题的背景与意义热休克蛋白是生物体内与抗逆相关的一类十分重要的蛋白。除高温诱导外，许多损伤因素、应激刺激（如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤、自由基等）作用后，都可以导致细胞发生热休克反应（谷文萍,1999），诱导热休克蛋白的合成。在不同条件引起的热休克反应中，热休克蛋白发挥着多方面的作用（MARTIN,1999）。热休克蛋白超家族HEATSHOCKPROTEINSUPERFAMILY是一类进化上高度保守的蛋白。这个家族包括至少6个亚家族HSP110家族，HSP90家族，HSP70家族，HSP60家族，H
2、SP20家族（小热休克蛋白家族），泛素（UBIQUITIN）等。热休克蛋白70（HSP70）家族是热休克蛋白超家族的重要成员，分子量约为68KD74KD。热休克蛋白70除了具有分子伴侣的功能以外，在消除重金属污染对机体造成的损伤（URANI,2001WARD,2001），调节受体数量（HELEN,2001），调理细胞凋亡（CHEN,2001）等方面都具有重要的作用。近年的研究表明HSP70还能促进抗原提呈，参与机体的免疫反应。在胚胎发育初期，HSP70对胚胎也有一定的保护作用。随着分子生物学技术和生物信息学技术的不断发展和完善，HSP70基因不断从不同种类的生物中被克隆出来，从而为深入研究HS
3、P70基因的功能及其表达调控规律奠定了基础。通过对大量生物的热休克蛋白70氨基酸序列进行研究表明，热休克蛋白70家族成员无论在一级结构上，还是在高级结构上都是高度保守的。因此本课题拟通过曼氏无针乌贼HSP70基因5端的克隆研究，然后合并分析已知的核苷酸序列，进一步进行多序列比对和等电点进化分化。为曼氏无针乌贼HSP70基因提供分子生物学方面的参考数据和理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1以CDNA为模板，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶纯化，连接转化提取质粒鉴定后送去生物公司测序。2测序的序列与已知序列合并，对该核苷酸序列进行分析。3对已知的核苷酸序列进行多序列比对和糖基化
4、位点分析。4对已知的核苷酸序列进行进化分析，并构建进化树。拟解决的问题克隆出曼氏无针乌贼HSP705端的基因，并对其进行分析，为曼氏无针乌贼HSP70基因研究提供科学数据与理论依据。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1RNA提取TRIZOL法提取RNA取肌肉组织，液氮冷冻后保存于80冰箱中备用。采用TRIZOL一步法提取RNA，在紫外分光光度计上测定纯度和浓度，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳/EB染色检测所提RNA的质量。具体步骤如下（1）在15MLRNASEFREE离心管中加入1MLTRIZOL，同时将其中少许TRIZOL留在离心管盖内；取50MG左右动物组织置于离心管盖内，用烘烤过的手术剪
5、将组织彻底剪碎；（2）冰上放置5MIN，以使核蛋白质裂解彻底；（3）每1MLTRIZOL加入02ML氯仿，剧烈振荡混匀30S，冰上放置3MIN；（4）台式高速冷冻离心机上，12000RPM4离心15MIN（离心后，混合物分为淡红色的酚仿相、中间相和无色的上层水相，RNA就存在于水相中，水相大约占60）；（5）将上清液小心转移到RNASEFREE15ML离心管里，加入05ML的异丙醇，冰上放置10MIN；（6）台式高速冷冻离心机上，12000RPM4离心10MIN（离心后，管底看见胶状RNA沉淀）；（7）弃上清，用1ML75酒精洗涤RNA沉淀，7500RPM4离心5MIN；（8）弃上清，室温下放
6、置510MIN，使酒精挥发；（9）加20LDEPCH2O溶解，80保存。2CDNA合成CDNA第一链的合成使用MMLV逆转录酶，操作步骤如下（1）在MICROTUBE中配制下列混合液反应液成分体积LCD2LRNA051LRNAFREEDH2O至8L（2）将MICROTUBE置于PCR仪或水浴锅中，72变性2MIN，迅速冰浴退火2MIN；（3）在上述MICROTUBE管中配制下列反转录反应液反应液成分体积LRRI（RNA酶抑制剂）1L5MMLVBUFFER4L10MMDNTP2LMMLV（逆转录酶）2LRNAFREEDH2O1LTOTALVOLUME10L将上述MICROTUBE管置于PCR仪或
7、水浴锅中，经4210MIN，然后加入SMART、SMART2、SMART3各1L混合后取2L，经4290MIN及7510MIN的反应后将其置于20保存。3聚合酶链式反应PCR根据已获得的部分核心序列，应用PRIMERPREMIER50引物设计软件，设计一对跨内含子的曼氏无针乌贼HSP70基因的特异性引物SMART/A和HSP5T（）。曼氏无针乌贼CDNA扩增采用TAKARA公司的LATAQTMPCRSYSTEM，25L反应体系成分如下10LATAQTMBUFFER25LDNTPMIXTURE各25MMOL/L2LSMART/A1LHSP5T（）1LCDNA05LDDH2O1775LLATAQT
8、MDNAPOLYMERASE025LPCR反应总体积25L检测采用TAKARA公司的RTAQTMDNA聚合酶体系，反应体系如下10RTAQTMBUFFER25LDNTPMIXTURE各25MMOL/L2LSMART/A1LHSP5T（）1LCDNA05LDDH2O1775LRTAQTMDNAPOLYMERASE025L反应总体积25LPCR流程如下94C变性2MIN后，作30个循环的扩增，每一循环包括94C变性2MIN、94C变性30S，54退火30S和72C合成052MIN。循环结束后72延伸反应10MIN以保证获得全长产物。PCR扩增产物经1W/V琼脂糖凝胶电泳分离。4DNA克隆41DNA
9、片段切胶纯化将25LPCR产物与10LAODINGBUFFER混合，并在1W/V琼脂糖凝胶中电泳120V，EB染色后漂洗，紫外灯下观察。切下预期大小的目的片段，用EZNATMGELEXTRACTIONKITOMEGA纯化，具体方法如下（1）将目的胶条置EPPENDORF管，加300LBINDINGBUFFER后置5560水浴10MIN，每23MIN颠倒混匀一次；（2）将混合液混匀后转入蓝管，10000G离心1MIN；（3）加300LBINDINGBUFFER，10000G离心1MIN；（4）弃滤液，加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；（5）弃滤液，另加700LWA
10、SHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；（6）弃滤液，13000G离心2MIN以彻底去除蓝管中的WASHBUFFER残留；（7）加入30LELUTIONBUFFER于蓝管，室温静置1MIN，13000G离心1MIN，收集产物30保存。42TA连接由于LATAQTMDNA，RTAQTMDNA及聚合酶进行PCR时，会在产物DNA的3末端形成一个游离的A，PMD19TSIMPLEVECTOR载体5端具有与之配对的单个T，可与PCR产物直接连接。连接体系及反应如下，连接产物可直接用于转化。2快速连接缓冲液5LPCR产物切胶纯化3LPMD19TSIMPLEVECTOR1LT4DNA连接酶1L
11、反应总体积10L16连接05H后4过夜43感受态细胞制备CACL2法（1）接种80长期保存的大肠杆菌菌株到5MLLB每升含10GTRYPTONE，5GYEASTEXTRACT，10GNACL，PH70液体培养基中，37摇床，200RPM，培养过夜12H左右；（2）按1100稀释到新鲜的LB液体培养基中，继续37摇床，200RPM，培养2H；（3）取出菌液置冰上冷却10MIN，将冰冷的菌液1ML每管分装到15ML的EPPENDORF管，8000G离心1MIN，弃上清；（4）沉淀用200L预冷的01MOL/LCACL2悬浮，冰浴30MIN后，8000G离心1MIN，弃上清；（5）沉淀再用100L0
12、1MOL/LCACL2重悬浮，冰浴放置524H备用。44转化和筛选（1）将10L连接产物加到100L感受态细胞中，冰浴放置30MIN；（2）在42水浴热激90S，立即转移到冰上冷却数分钟；（3）加入冰预冷的LB培养液890L后，37摇床低速170180RPM培养1H；（4）在预先涂布XGAL和IPTG的LB平板上液体LB培养基中添加15琼脂粉，取100L转化后的培养菌液，涂布于含氨卞青霉素50100G/ML，37培养箱过夜培养1014H；（5）筛选白色菌落置5ML含氨卞青霉素50100MG/MLLB培养液，37摇床，200RPM，培养812H。45质粒提取根据不同目的，本文采用两种方法提取质粒
13、，其中粗提采用碱裂法小量制备质粒，用于检测。采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒OMEGA，用于双酶切。A裂解法粗提质粒（1）取1ML菌液于15ML的EPPENDORF管中，离心8000G，1MIN，弃去上清；（2）加入溶液I50MMOL/L葡萄糖，10MMOL/LEDTA，25MMOL/LTRISCLPH80100L，剧烈震荡使细胞悬浮；（3）加新鲜配制溶液II02MOL/LNAOH，1SDS200L，轻柔颠倒数次，待菌悬浮液澄清；（4）加入150L溶液III3MOL/LKAC，2MOL/LHAC，混匀后离心13000G，10MIN；（5）将380L上清转移至新EPPENDORF
14、管中，加异丙醇720L，颠倒数次后离心13000G，10MIN；（6）弃上清，沉淀自然干燥后加50L无菌水溶解SAMBROOKETAL，1989。BEZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒OMEGA法（1）取3050ML的菌液，于室温下5000G，离心10MIN，沉淀菌种；（2）倒出或吸掉培养基，往沉淀中加入25ML的SOLUTION/RNASEA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；（3）转移细胞悬溶液到3050ML的离心管中，往重悬混和液中加入25MLSOLUTION，盖上盖子，轻轻的但要彻底混匀，颠倒1015次以获得澄清裂解物。如有必要，可把裂解液置于室温静置2MIN；（4）往上述混和
15、液中加入35MLSOLUTION，盖好盖子，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀，于室温最好4下12000G，离心10MIN；（5）小心吸取37ML上清液到中量结合柱，结合柱套上15ML的收集管，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下5000G离心35MIN，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中滤液并把柱子重新装在15ML收集管中。重复这一步，直至将全部样品通过柱子，弃去流出液（收集管重复使用）。（6）加入3MLBUFFERHB到中量柱子中，室温下5000G离心35MIN，弃去收集管中的滤液，在下一步中重复使用收集试管；（7）加入35MLDNAWASHBUFFER用无水乙醇稀
16、释的洗涤柱子，室温下5000G离心35MIN，弃去洗涤液；（8）重复步骤8，再用35ML的DNAWASHBUFFER洗涤柱子一次；（9）室温下5000G离心空柱1015MIN以甩干柱子基质。（10）进一步干燥柱子，在65烘箱中处理10MIN，移走柱子；（11）把柱子置于一干净的15ML小离心管上，直接加入051MLELUTIONBUFFER到柱子基质上，室温下静置2MIN，5000G离心5MIN，洗脱出DNA，纯化的质粒于30保存。5检测51重组质粒的鉴定将碱裂法抽提的质粒与10上样缓冲液混匀后，1琼脂糖凝胶电泳，选择大小合适的重组质粒进行PCR检测，PCR检测体系如前。PCR产物经1琼脂糖凝
17、胶电泳分离。鉴定为目的重组质粒后，将目的菌株的菌液加10甘油混匀后置于80保存。52序列测定和分析取一部分菌液用封口膜封好后寄出测序，测序由上海华大公司测定,采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序。序列分析采用BLASTP分析软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DDBJ软件CLUSTALW程序HTTP/CLUSTALWDDBJNIGACJP/，系统进化分析由MEGA30版程序完成。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度201001201002毕业论文选题。201002201003进行文献查阅和资料收集，制定具体研究计划和试验方案。20
18、1003201004材料整理、分析，开始进行综述撰写。201004201005开题答辩与综述。201004201007进行曼氏无针乌贼HSP70基因5端的克隆实验。201008201011数据和材料整理、分析。201012201102完成2篇外文翻译。资料查询HSP705端基因克隆序列分析PCR扩增数据整理，论文撰写切胶回收连接转化分析序列送去测序多序列比对糖基化分析进化分析提取质粒201102201105论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1陈劲松,夏双印,杨大平HSP70在鼠背轴型皮管IPC后的保护作用的实验研究J中国急救医学,2001,2131391412谷文萍热休克蛋白70研究进展J
19、国外医学神经病学神经外科学分册,1999,26257593郑磊,颜晓慧,邹飞,等热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用J国外医学卫生学分册,1999,2642092124BOSTONRS,VIITANENPV,VIERLINGEMOLECULARCHAPERONESANDPROTEINFOLDINGINPLANTJPLANTMOLBIOL,1996,32121912225BURDONRHHEATSHOCKPROTEINSINRELATIONTOMEDICINEJMOLASPECTSMED,1993,142831656CAOY,MATSUMOTOT,MOTOMURAK,ETALIMPAIREDI
20、NDUCTIONOFHEATSHOCKPROTEINIMPLICATEDINDECREASEDTHERMOTOLERANCEINATEMPERATURESENSITIVEMULTINUCLEATEDCELLLINEJJCELLBIOCHEM,1998,7119147CONROYSE,LATCHMANDSDOHEATSHOCKPROTEINSHAVEAROLEINBREASTCANCERJBRJCANCER,1996,7457177218CURANIETALCOPPERANDZINCUPTAKEANDHSP70EXPRESSIONINHEPG2CELLSJTOXICOLOGYINVITRO,20
21、01,154975029DICHENHEATSHOCKPROTEIN70MODERATELYENHANCESPEPTIDEBLINDINGANDTRANSPORTBYTHETRANSPORTERASSOCIATEDWITHANTIGENPROCESSINGJIMMUNOLOGYLETTERS,2001,7514314810DEBORAHAR,MICHAELWG,ROCHELLEB,ETALINCREASEDEXPRESSIONOFTHEHSP70COCHAPERONEHSPBP1INTUMORSJTUMORBIOLOGY,2003,24628111GROSSC,HANSCHD,GASTPARR
22、,ETALINTERACTIONOFHEATSHOCKPROTEIN70PEPTIDEWITHNKCELLSINVOLVESTHENKRECEPTORCD94JBIOLCHEM,2003,38426712GETTINGMJ,SAMBROOKJPROTEINFOLDINGINTHECELLJNATURE,1992,355334513GEORGOPOULOSC,WELCHWJROLEOFTHEMAJORHEATSHOCKPROTEINSASMOLECULARCHAPERONESJANNUREVCELLBIOL,1993,960163414GABAIVL,MERIINAB,MOSSERDD,ETAL
23、HSP70PREVENTSACTIVATIONOFSTRESSKINASESANOVELPATHWAYOFCELLULARTHERMOTOLERANCEJBIOLCHEM,1997,272291803318037715GARCIABL,ETALTHESIGNIFICANCEOFLIPIDSATEARLYSTAGESOFMARINEFISHAREVIEWJAQUACULTURE,1997,1551410311516HELENMBSTRESSMANAGEMENTHEATSHOCKPROTEIN70ANDTHEREGULATIONOFAPOPTOSISJTRENDSINCELLBIOLOGY,200
24、1,11161017HUGHRBPELHAM,ETALAREGULATORYUPSTREAMPROMOTERELEMENTINTHEDROSOPHILAHSP70HEATSHOCKGENEJCELL,1982,3051752818HENDRICKJP,HARTLFUMOLECULARCHAPERONEFUNCTIONOFHEATSHOCKPROTEINSJANNUREVBIOCHEM,1993,6234938419JULIANNGK,GEORGECTHEATSHOCKPROTEIN70KDAMOLECULARBIOLOGY,BIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYJPHARMACOL
25、THER,1998,80218418520LINDQUISTSTHEHEATSHOCKRESPONSEJANNUREVBIOCHEM,1986,551151119121MACIEJZ,FRANKWK,ALICJAWHSP70INTERACTIONSWITHTHEP53TUMORSUPPRESSORPROTEINJTHEEMBOJOURNAL,2001,20174634463822MARBERMS,WALKERJM,LATOMANDS,ETALMYOCARDALPROTEINAFTERWHOLEBODYHEATSTRESSINTHERATITISDEPENDENTONMETABOLICSUBST
26、RATEANDISRELATEDTOTHEAMOUNTOFINDUCIBLE70KDHEATSTRESSPROTEINJJCLININVEST,1994,933108723MARTINEFHEATSHOCKPROTEINS,MOLECULARCHAPERONES,ANDTHESTRESSRESPONSEEVOLUTIONARYANDECOLOGICALPHYSIOLOGYJANNUREVPHYSIOL,1999,6124328224RITOSSAFEXPERIENTIAJ1962,1857125ROYH,BURDONHEATSHOCKANDTHEHEATSHOCKPROTEINSJBIOCHE
27、MJ,1986,24031332426RAKONCZAYZJ,MANDIY,KASZAKIJ,ETALINDUCTIONOFHSP72BYSODIUMARSENITEFAILETOPROTECTAGAINSTCHOLECYSTOKINOCTAPEPTIDEINDUCEDACUTEPANCREATITISINRATSJDIGDISSCI,2002,4771594160327SLINDGUIST,EACRAIGTHEHEATSHOCKPROTEINSJANNUREVGENET,1988,2263167728SHINBK,WANGH,YIMAM,ETALGLOBALPROFILINGOFTHECEL
28、LSURFACEPROTEOMEOFCANCERCELLSUNCOVERSANABUNDANCEOFPROTEINSWITHCHAPERONEFUNCTIONJJBIOLCHEM,2003,278760729SREEDHARAS,PARDHASARADHIBV,BEGUMZ,ETALLACKOFHEATSHOCKRESPONSETRIGGERSPROGRAMMEDCELLDEATHINARATHISTIOCYTICCELLLINEJFEBSLETT,1999,456233934230TISSIERESA,ETALJMOLECBIOLJ1974,3438931TODRYKSM,GOUGHMJ,P
29、OCKLEYAGFACETSOFHEATSHOCKPROTEIN70SHOWIMMUNOTHERAPEUTICPOTENTIALJIMMUNOLOGY,2003,11011432WARDLTHEROLEOFHEATSHOCKPROTEIN70INVITAMINDRECEPTORFUNCTIONJBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS,2001,2821211121933WANGTT,CHIANGAS,CHUJJ,ETALCONCOMITANTALTERATIONSINDISTRIBURIONOF70KDHEATSHOCKPROTEINS,CYTOSKELETONANDORGANELLESINHEATSHOCKED9LCELLSJINTJBIOCHEMCELLBIOL,1998,30674575934YAMAGISHIN,SAITOY,ISHIHARA,ETALENHANCEMENTEMBRYONALF9CELLSJEURBIOCHEM,2002,26941434151
