1、毕业论文开题报告水产养殖诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢免疫活性的影响一、选题的背景与意义乌鳢（OPHICEPHALUSARGUS），亦称黑鱼，属鲈形目，攀鲈亚目，鳢科，鳢属，体呈乌黑色，细长，前部圆筒状，后部侧扁，由背至腹颜色逐渐变浅，圆鳞。乌鳢分布极广，除西部高原地区外，从黑龙江至海南的河川、湖泊、水库、池塘等各种类型的水体皆产此鱼，国外产于朝鲜西、南部。乌鳢肉富含蛋白质、脂肪、18种氨基酸等，还含有人体必需的钙、磷、铁及多种维生素，营养丰富、肉味甘性温且骨刺少，有补脾、利水的药用功能，深受群众的欢迎。乌鳢是一种适应性强、对不良水温、水质及缺氧条件有较强耐受力的鱼类，在江河湖塘等自然环境中
2、很少发病。但随着乌鳢人工高密度养殖的发展，乌鳢各种疾病频频发生，特别是水霉病、腐皮病、腹水病、烂鳃病危害严重，诺卡氏菌病也在近几年流行起来，造成了很严重的经济损失。诺卡氏菌（NOCARDIA）为革兰氏阳性菌，好氧，分类上属细菌域，厚壁菌门，放线菌纲，放线菌目，诺卡氏菌科。菌体呈长或短杆状,或细长分枝状，常断裂成杆状至球状体，基丝发达，呈分枝状，气丝较少。鱼类诺卡氏菌病于1963年在全球首次报告，确认于阿根廷热带养殖的虹彩脂鱼（HYPHESSOBRYCONINNESI）（杜佳根2007）。随后此病又陆续发生在虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）、黄尾鰤（SERIOLALALANDI）、乌
3、鳢、大西洋牡蛎（CRASSOSTREAGIGAS）、大口鲈（MICROPTERUSSALMOIDES）和海鲈（LATEOLABRAXJAPONICUS）等水产养殖动物中，曾影响日本、美国、澳大利亚、加拿大等地的水产养殖业，造成很大经济损失（袁思平2006）。该病曾是日本水产养殖中最主要的水产动物疾病之一,也是大西洋牡蛎养殖的主要疾病。而该病近年来对我国台湾水产养殖业也产生了较大影响，先后在乌鳢、大口鲈和海鲈等养殖鱼类中发生此病。我国大陆是2006年首次在养殖大黄鱼中发现诺卡氏菌病（王国良2006）。肽聚糖PEPTIDOGLYCAN又称粘肽、胞壁质或粘质复合物，由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成
4、，是N乙酰葡萄糖胺（NAG）和N乙酰胞壁酸（NAMA）交替连接的杂多糖与不同组成的肽交叉连接形成的多层网状大分子结构。其是一种多糖与氨基酸相连的多糖复合物，由于此复合物中氨基酸链不像蛋白质中的那样长，故称肽聚糖。肽聚糖是许多细菌细胞壁的主要成分，不同的肽聚糖中出现的氨基酸数是有限的，亚肽单位及间肽桥上氨基酸的组成及排列上的不同，决定了肽聚糖种类的多样性和致中1992。近年来的大量的研究结果表明，肽聚糖具有包括佐剂活性在内的多种生物活性。肽聚糖能对免疫系统产生不同的免疫调节作用，能够增强机体免疫能力，是一种免疫系统的免疫增强剂。肽聚糖能够刺激B、T淋巴细胞，增强体液免疫和细胞免疫，激活单核细胞及
5、多核白细胞的吞噬活性，活化补体闻玉梅等1992，其分子中的多糖成分还具有抗肿瘤，抗感染能力（TAKASHI1994）。在水产养殖中投喂肽聚糖后发现，其能显著提高水产动物如五条鰤（TTAMI1996）、斑节对虾（SITDHIBOONYARATPALIN1995）、日本对虾（ITAMI1998）等抗病力和成活率。因此，使用肽聚糖有利于解决水产养殖中大量使用抗生素药物防治病害所表现出的生物抗药性问题及食品的药物残留问题。本实验通过对乌鳢人工注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物，研究其对乌鳢免疫活性指标的影响，为乌鳢诺卡氏菌病的防治提供理论参考。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究基本内容1诺卡氏菌细胞
6、壁肽聚糖的分离提取。2通过腹腔注射的方式，对乌鳢注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物，研究其对乌鳢免疫活性指标的影响。拟解决的主要问题1诺卡氏菌细胞壁肽聚糖的提取方法。2乌鳢免疫活性指标的筛选及测定方法的建立。三、研究的方法与技术路线研究的方法1试验用鱼乌鳢2试验用菌鰤鱼诺卡氏菌NACARDIASERIOLEA3试剂与药品三氯乙酸（TCA）、胰蛋白酶磷酸缓冲液3MG/ML胰蛋白酶、01MOL/L磷酸缓冲液、PH80、肝素钠、生理盐水、白细胞稀释液（冰醋酸15ML、1龙胆紫1ML、蒸馏水975ML）、溶壁微球菌MICROCROCOCCUSLYSODEIKTICUS、红细胞稀释液（NACL05G、硫酸钠
7、25G、氯化汞025G、蒸馏水加至100ML）、溶壁微球菌营养琼脂培养基（牛肉浸膏15G、蛋白胨25G、NACL40G、琼脂75G、蒸馏水500ML、PH74）、丙酮、乙醚等。4主要器材玻璃缸、注射器、生化自动分析仪、离心机、显微镜等5实验方法51诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物的制备参考宋晓玲等（2005）改进的PARK法。取离心洗涤得到的诺卡氏菌湿菌20G，悬浮于200ML10三氯乙酸TCA溶液中，沸水浴20MIN以裂解菌体；冷却后，12万R/MIN离心15MIN，收集不含磷壁酸的细胞壁沉淀，蒸馏水洗涤沉淀3次；沉淀溶于胰蛋白酶磷酸缓冲液3MG/ML胰蛋白酶；01MOL/L磷酸缓冲液；PH80中
8、，37水浴振荡3H，以3000R/MIN转速离心5MIN，弃去未溶解的胰蛋白酶沉淀。上清液12万R/MIN离心15MIN，沉淀用蒸馏水洗2次，加入乙醚除脂类物质12万R/MIN离心15MIN，70干燥脱水后，即得淡褐色胶质肽聚糖提取物。最后，将制备的肽聚糖干燥物用生理盐水配成1浓度的溶液，高温高压灭菌20MIN后备用。52腹腔注射与血样采集试验分对照组和试验组，每组50尾鱼。试验组腹腔注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物每尾03ML，对照组以同量无菌生理盐水注射。注射后分别于24H、48H、72H、96H、120H、144H、168H时尾静脉取血液样本，每时间点每组取5尾鱼，实验重复2次。用肝素钠作
9、为血液抗凝剂，臀鳍尾端基部无鳞处穿刺抽血,取得全血，测定红细胞数量、脆性及白细胞数量等生理指标，当天完成测定；用5ML针筒尾静脉取血（不抗凝），全血制备血清，4静置过夜，吸出血清后3000R/MIN离心，用于溶菌酶等生化指标的测定。53溶壁微球菌粉末的制备将溶壁微球菌涂布于营养琼脂上，28下培养过夜，用无菌重蒸水将溶壁微球菌菌落从营养琼脂平板上洗下来，2500R/MIN离心15MIN，去上清，用4ML丙酮洗涤后，2500R/MIN离心3MIN，去上清，重复2次，再用4ML乙醚洗涤，2500R/MIN离心3MIN，重复1次，把溶壁微球菌从离心管中取出，放到研钵中，于28下干燥3H，把结块的细菌磨
10、成粉末分装到小离心管中,4下保存备用。54免疫活性指标的测定541红细胞计数（RBC）用红细胞稀释液将血液稀释200倍，用NEUBARNER计数板在显微镜下计数。542白细胞计数（WBC）用TRK稀释液将血液稀释200倍，用NEUBARNER计数板在显微镜下计数。543红细胞脆性EOB将血液滴入浓度为020048梯度为002的NACL溶液，以完全溶血的NACL浓度作为红细胞最大抵抗值。544溶菌酶活力测定主要根据简纪常的方法进行。用0067MOL/LPBSPH64将溶壁微球菌配成02MG/ML的菌悬液，每个样品取3ML菌悬液，吸取40L血清加入到3ML菌悬液中，混匀后立刻在540NM下测定A0
11、值。然后在28水浴中温浴30MIN，取出后置于4冰浴中以终止反应，再测定A值，按公式计算溶菌酶的活力UA0A/A。545血清酶类的测定碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶ACP、乳酸脱氢酶LDH等在生化自动分析仪上完成，具体方法根据说明书进行。5数据处理与分析利用统计软件SPSS130对试验结果进行分析。每个样品进行3次平行测试取平均值，所有数据分析均采用单因素方差分析ONEFACTORANALYSISOFVARIANCE和DUNCAN检验法。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年1月2010年4月1实验前的准备工作查找资料，写开题报告和论文综述；2仪器、药品的准备和各种实验材料的准备。201
12、0年5月2010年12月1诺卡氏菌细胞壁肽聚糖的分离提取。2研究诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢免疫活性指标的影响。3、翻译外文文献。2011年1月2011年4月1、补充相关数据，整理试验结果；查阅资料，完成开题报告和综述仪器、药品和各种实验材料的准备购得健康乌鳢（成体），暂养注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物分别于24H,48H,72H,96H,120H,144H,168H时间点采样红细胞计数红细胞脆性测定白细胞计数血清酶类的测定数据处理与分析撰写论文溶菌酶活力测定诺卡氏菌的培养诺卡氏菌细胞壁肽聚糖的提取论文答辩2、撰写论文初稿。3、论文定稿，论文答辩。五、主要参考文献1陈晓耘鱼类的血液J重庆师
13、专学报,2000,19370732陈寅儿,金珊,王国良鲈鱼溶藻弧菌病的血液生理生化指标研究J台湾海峡,2005,011041083陈国胜,谷欣,张想竹细菌肽聚糖及其应用安阳工学院学报200736384杜佳根鱼类诺卡氏菌病危害状况与研究进展辽宁省大连市大连水产学院,2007527315和致中1992细菌细胞壁肽聚糖的分类微生物学通报,1931741796金珊,蔡完其,王国良,等养殖大黄鱼细菌性疾病的病原研究J浙江海洋学院学报,2002,2132252317金珊,王国良,赵青松,等鲈细菌性类结节病的病原及血液病理研究J水产学报,2004,067037088金珊,王国良,赵青松,等加州鲈白云病的病原
14、及血液病理的初步研究J水生生物学报,2005,021841889李懋,黄二春,魏于生,等淡水鲳六项血液指标的测定及血细胞结构的显微观察J淡水渔业,1992,3202310林光华鲤鱼血液的研究J动物学报,1979,0921021911米瑞芙,陶烦春,王晓梅,等鲢败血症血液生理指标的变化J淡水渔业,1993,234161912米瑞芙草鱼、鲤和鲢血液学指标的测定J淡水渔业,19824101613梅广海,朱永生,曹格,等越冬罗非鱼细菌性类结节病的初步研究J水产科学,2002,21491114庞启华,黄文芳,谢凤丰产鲫细菌性败血症的血液病理变化J应用与环境生物学报,200410331531715宋晓玲,
15、杨旭彤,偲翰文,等双歧杆菌细胞壁肽聚糖的分离及其对两种海产动物免疫活性的影响J水产学报2005,29335035316闻玉梅,陆德源现代微生物学第2版,上海上海医科大学出版社,19921217邢维贤,安利国,傅荣恕鲤鱼竖鳞病的血液病理学研究山东师大学报自然科学版199612848618余毅,吴宝华白鲢疯狂病血液的研究A中国水产学会第四次全国会员代表大会暨学术年会论文集C1988,20020319袁思平,王国良,金珊养殖鱼类致病诺卡氏菌研究进展J微生物学通报,2006,0213714120周玉,郭文场,杨振国,等鱼类血液指标研究的进展J上海水产大学学报,2001,10216316521周玉,郭文
16、场,杨振国,等欧洲鳗鲡”狂游病”血液生化指标研究J水生生物学报,2002,26331431622TAKASHIS,FUKAMIS,SHIGEONAMIOKAEHANCEDRESISTANCEOFMICETOESCHERIEHIACOLIINFECTIONINDUCEDBYADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLYCANDERIVEDFROMBIDOAOTERIUNTHERMOPHYLUMJVETMEDICALSCI,19945643323ITAMIT,KONDOMUOZUMETALENHANCEMENTOFDISEASERESISTANCEAGAINSTENTEROCOCCUSSER
17、IOLICIDAINFECTIONINYELLOWTAILSERIOLAQUINQUERADIATATEMMINCKANDSCHLEGELBYORALADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLYCANDERIVEDFROMBIFIDOBACTERIUMTHERMOPHILUMJJFISHDIS19961918518724ITAMIT,MASAYAAENHANCEMENTOFDISEASERESISTANCEOFKURUMASHRIMP,PENAEUSJAPONICUSAFTERORALADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLICANDERIVEDFROMBIFIDOBACTERIUMTHERMOPHILUMJAQUACUTURE。199816427728825SITDHIB,MALIBEFFECTSOFPEPTIDOGLYCANPGONGROWTH,SURVIVAL,IMMUNERESPONSEANDTOLERANCETOSTRESSINBLACKTIGERSHRIMP,PENAEUSMONODONJDISEASESINASIANAQUACULTUREII1995469477
