1、毕业论文开题报告水产养殖三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与组织表达一、选题的背景与意义三疣梭子蟹是我国大型海养蟹类，具有十分重要的经济价值和营养价值，也是我国沿海水产养殖重要的经济种。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRIUBERBUCULATUS）属于甲壳纲（CRUSTACEA）、十足目（DECAPODA）、梭子蟹科（PORTUNUIDAE）、梭子蟹属（PORTUNUS），地方名有梭子蟹、枪蟹、海螃蟹、水蟹等。随着水产养殖业的全面发展，三疣梭子蟹的养殖也在沿海蓬勃兴起，养殖规模日趋增大，其病害也随之多起来，目前三疣梭子蟹的病害对其养殖产量造成了不可忽视的损失，因此，对于三疣梭子蟹的病害防治和研究十分
2、必要。目前，对三疣梭子蟹的研究在分子生物学方面已经展开，为我们了解三疣梭子蟹提供了很大的帮助，但有关梭子蟹病害防控方面的研究资料还很少，主要集中在对病原的分离鉴定（许文军2005；王国良2006）、疾病的诊断及防治技术研究（赵青松2005；金珊2006）等，而有关免疫学方面的研究几乎没有。三疣梭子蟹由于无特异性免疫，因此其先天免疫的“非己”识别更为重要，这种“非己”识别是因为存在某些特异性的模式识别受体PRRS，它能够识别并结合微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相关分子模式PAMPS，如脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖、病毒DSRNA、细菌DNA等GU，2001。由于这些大
3、分子对微生物的存活是必需的，因此微生物不能通过改变PAMPS来避免被先天免疫系统识别DU，2007。目前，对先天免疫识别的研究主要集中在哺乳动物（MEDZHITOV1997；LEVASHINA2001；LIU2002）、昆虫（WERNER2000；GOTTAR2002；KANOST2004、线虫LEVASHINA2001等，而水产动物模式识别受体的研究相对较少，主要针对淡水螯虾、凡纳对虾、南美白对虾、中国明对虾等虾类LEE2000；SU2004；王金星2004；CHENG2005；梁虹2006；CHIU2007和扇贝（苏建国2004，胥炜2005）、中华绒螯蟹（ZHAO2009）等。LGBP（
4、LIPOPOLYSACCHARIDEANDBETA1，3GLUCANBLINDINGPROTEIN），即脂多糖1，3葡聚糖结合蛋白，它能够识别G细菌和真菌的细胞壁多糖成分脂多糖和1，3葡聚糖。在异物侵入机体时，LGBP不仅能够促进血淋巴细胞的吞噬、黑化、包囊、凝集等作用，而且还可以激活蛋白酶级联反应，引起抗菌肽的合成YUETAL，2002），因此，它在无脊椎动物的免疫系统中占有重要地位。本项目对三疣梭子蟹LGBP基因进行克隆与表达研究，不仅对深入了解三疣梭子蟹先天性免疫功能和调节机制、丰富和发展无脊椎动物免疫学的内容具有重要的理论意义，而且对三疣梭子蟹免疫增强剂的研发及水产动物疾病的防治都具有
5、重要的指导价二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究基本内容1、三疣梭子蟹LGBP基因的克隆和序列分析；2、LGBP在三疣梭子蟹血细胞、鳃、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺等主要组织中的表达差异。拟解决的主要问题1、三疣梭子蟹LGBP基因的序列及氨基酸序列结构特征；2、LGBP在三疣梭子蟹各主要组织中的表达调控规律。三、研究的方法与技术路线研究的方法1试验材料三疣梭子蟹，溶藻弧菌，酵母菌2试剂与药品MRNA纯化试剂盒，RACE反应试剂盒，TAQDNA聚合酶，05MLPCR反应管等。3主要仪器微量移液器，台式高速冷冻离心机，台式摇床，磁力搅拌器，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统，恒温
6、水浴等。4细菌刺激实验溶藻弧菌和酵母菌于实验前一天活化，两种菌高温高压灭活后分别配成107CELLML1备用，使用前等比例混合两种菌液。用混合菌悬液刺激健康三疣梭子蟹，定时取健康蟹和刺激蟹的血细胞等组织用于总RNA的提取和其它实验。5三疣梭子蟹总RNA的提取采用上海博星UNIZOL试剂提取三疣梭子蟹总RNA，具体方法参照说明书。提取的总RNA经紫外分光光度计检测并确定其完整性后，在80保存备用。6LGBP基因片段克隆查询GENBANK数据库，结合其他动物同源LGBP基因的保守序列设计简并引物，以三疣梭子蟹血细胞CDNA为模板进行PCR扩增，扩增到的DNA片段连接到T载体，转化感受态细胞后进行测
7、序。7LGBP基因全长CDNA克隆用RACE方法克隆目的基因。比对以上实验得到的LGBP部分序列与其他无脊椎动物LGBP基因的同源性，根据此测得序列设计正向和反向特异性引物，用于5RACE和3RACE方法克隆LGBP基因的5末端和3末端序列，最后拼接获得LGBP基因的全长CDNA。8LGBP基因序列分析采用生物信息学方法对LGBP基因序列进行同源性比较、全长序列ORF分析；对CDNA推导的氨基酸序列及LGBP的结构进行分析，预测LGBP的功能域。用BLAST软件（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST）对该基因的氨基酸和核苷酸的同源性进行分析，用CLUSTALW程序（HTTP/
8、WWWEBIACUK/CLUSTALW）进行多序列比对。9LGBP基因组织表达分析取0、6、12、24、48、72H刺激组及生理盐水对照组的不同三疣梭子蟹组织（血细胞、鳃、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺），采用RTPCR方法，以ACTIN基因作为内标，来检测不同三疣梭子蟹组织中LGBPMRNA的表达情况及动态变化。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年1月2010年4月1、实验前的准备工作查找资料，写开题报告和论文综述；2、仪器、药品的准备和各种实验材料的准备。2010年5月2010年12月1、三疣梭子蟹LGBP基因的克隆及序列分析。细菌刺激三疣梭子蟹总RNA提取三疣梭子蟹LGBP基因核心序列的
9、克隆LGBP全长基因的获得进行目的基因的序列分析查找资料，写开题报告和综述仪器、药品和各种实验材料的准备购得健康三疣梭子蟹成蟹，暂养SMARTCDNA的合成取0、6、12、24、48、72小时以及生理盐水对照组的不同三疣梭子蟹组织（血细胞、鳃、肝胰腺、心脏、肌肉）用RTPCR方法，以ACTIN基因作为内标，来检测不同组织中LGBPMRNA的表达情况及动态变化。组织表达分析撰写论文论文答辩2、LGBP基因的组织表达研究3、翻译外文文献。2011年1月2011年4月1、补充相关数据，整理试验结果；2、撰写论文初稿。3、论文定稿，论文答辩。五、主要参考文献1ROXANABH,GIANEMDEVELO
10、PMENTOFAPCRPROTOCOLFORTHEDETECTIONOFAEROMONASSALMONICIDAINFISHBYAMPLIFICATIONOFTHEFSTA（FERRICSIDEROPHORERECEPTOR）GENEJVETERNITYMICROBIOLOGY,2008,1283963942MINESA,GALLACHERAAELIABLERTPCRELISAMETHODFORTHEDETECTIONOFINFECTIOUSPANCREATICNECROSISVIRUS（IPNV）INFARMEDRAINBOWTROUTJJOUYURNALOFVIROLOGICALMETHO
11、DS,2006,13292963YONGCL,BASKARALINGAMV,JIANNCCIDENTIFICATIONANDPHYLOGENETICANALYSISONLIPOPOLYSACCHARIDEAND1,3GLUCANBINDINGPROTEINLGBPOFKURUMASHRIMPMARSUPENAEUSJAPONICUSJDEVELOPMENTALANDCOMPARATIVEIMMUNOLOGY,2008,32126012694XINJD,XIAOFZ,JINXWMOLECULARCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFALIPOPOLYSACCHARIDEAND1
12、,3GLUCANBINDINGPROTEINFROMFLESHYPRAWNFENNEROPENAWUSCHINENSISJMOLECULARIMMUNOLOGY,2007,446108510945高保全,刘萍,李健,等三疣梭子蟹野生群体同工酶的遗传多态性分析J水产学报,2007,301166高排山,施陆三疣梭子蟹与脊尾白虾混养初探J科学养鱼,2004726277郭天慧,孔晓喻,陈四清,等三疣梭子蟹线粒体DNA、16SRRNA和COI基因片段序列的比较研究J中国海洋大学学报,2004,34122288胡雪峰,石存斌,潘厚军,等海水养殖斜带石斑鱼溃疡病病原菌溶藻弧菌的初步研究J中国海洋大学学报,2
13、005,3522322369金珊,赵青松,王春琳,等,梭子蟹科六种海产蟹的RAPD标记J动物学研究,2004,25217217610姜志聃,唐日峰,陈广凤利用虾池养殖三疣梭子蟹的技术措施J中国水产,20007363711孔晓瑜,刘亚军,喻子牛,等栉孔扇贝和海湾栉孔扇贝线粒体16SRRNA基因片段的比较研究C贝类学论文集第IX辑,北京海洋出版社,2002596212刘永,许强华,陈新军,等浙江近海三疣梭子蟹群体遗传结构的初步分析J上海海洋大学学报,2008,180213714113梁虹,王安利,王维娜无脊椎动物模式识别蛋白研究进展J生理科学进展,2006,37215615914柳峰松中国明对虾（
14、FENNEROPENAEUSCHINENSIS）抗菌因子及模式识别蛋白的研究D中国科学院研究生院（海洋研究所）,200515孟庆显,余开康鱼虾蟹贝疾病诊治和防治M北京中国农业出版社,1996,25528116孙红英,周开亚,陆健健,等中国大陆绒螯蟹线粒体16SRDNA变异与分子标记鉴定J自然科学进展,2002,12548549017陶保华,石和荣黄俊文,等假单胞菌引起罗氏沼虾黄鳃、黑鳃病的研究J中山大学学报自然科学版,2000,39S125525918王国良,金珊,陈寅儿,等三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究J海洋科学进展,2006,24452653119王建波ISSR分子标记及其在植物
15、遗传学研究中的应用J遗传,2002,25561361620王建平,余晓巍,沈庞幼,等三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）微卫星位点的分离和序列分析J海洋与湖沼,2009，4001848721王虹玲从三疣梭子蟹中检出白斑杆状病毒的实验报告J中国卫生检验杂志,2005,15111822王广成,王权,李欣,等三疣梭子蟹高产高效养成技术J水产科技情报,2005,32311011223许文军,徐汉祥,金海卫,等梭子蟹“乳化病“病原的研究J浙江海洋学院学报自然科学版,2003,22320921324许文军,徐汉祥,金海卫梭子蟹“乳化病“病原的研究J浙江海洋学院学报,2003,22320921325徐敬明蟹类线粒体DNA的研究与应用J中国海洋大学学报,200636687988426薛俊增,堵南山,赖伟中国三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULAMSMIERS的研究J东海海洋,1997,154606427余红卫,朱冬发,韩宝芹三疣梭子蟹不同组织同工酶的分析J动物学杂志,2005,401848728袁列伟,郑志光三疣梭子蟹二茬池塘养殖试验J浙江海洋学院学报,2004,23435135329张继泉中国明对虾免疫等相关基因的克隆、重组表达与功能分析D中国科学院研究生院（海洋研究所）,2005
