1、第八章 DNA序列测定,王 文 君,广州中医药大学分子生物学技术实验室免疫研究室,自然界中物种(生物)的丰富多样性是由其生命本质决定的，物种的本质特征的多样性首先体现在其DNA序列的多样性(病毒为RNA)，这种千差万别的DNA序列正是自然界中形态和功能各异的物种的基石。我们要了解各物种的本质特征，就必需从其DNA的一级结构上开始。因为其DNA的一级结构是各物种生理功能的基础，也是我们对其进行深入研究的出发点。,DNA是物种生存和发展的基石,一、物种的生存 DNARNA多肽,二、物种的繁衍,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,测 序 方 法DNA序列测定是在高分辨率变性聚丙烯
2、酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。可分离相差仅1个碱基的300500bp的核酸分子。一.双脱氧末端终止法二.化学裂解法三.基因芯片法,1977年，Sanger在加减法基础上提出了双脱氧末端终止法测序，其原理如下： 四个反应管中，在DNA聚合酶催化下，以单链DNA为模板，加入单引物、四种dNTP，以及每管中加入双脱氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。双脱氧核苷酸(ddNTP)的5端-OH是正常的，而其3端-OH则没有，因此能与引物延伸链的3端连接，而不能连接其后继核苷酸，于是引物链的延伸至此结束，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据电泳图谱即可拼出所测DNA序列（即DNA的核苷酸顺序）。
3、,A反应,G反应,T反应,C反应,DNA聚合酶Mg离子DNA模板引物 dNTPsddATP,DNA聚合酶Mg离子DNA模板引物 dNTPsddGTP,DNA聚合酶Mg离子DNA模板引物 dNTPsddTTP,DNA聚合酶Mg离子DNA模板引物 dNTPsddCTP,O,碱基G、C、A、T,C,O,HPO,OH,脱氧核糖核苷酸(dNTP)的分子结构式,1,2,3,4,5,P,O,碱基G、C、A、T,C,HPO,双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)的分子结构式,1,2,3,4,5,O,核苷酸链示意图,末端终止法图解,正常,双脱氧ddNTP,3ATTGCGATCTAGTGGCTAATG5,CGCTAGAT
4、CACCGATTAC,5TAA,3ATTGCGATCTAGTGGCTAATG5,5TAA,CGCTA,5TAA,CGCTAG,5TAA,5TAA,5TAA,5TAA,CGCTAGA,CGCTAGAT,CGCTAGATC,CGCTAGATCA,5TAA,5TAA,CGCTAGATCAC,CGCTAGATCACC,末端终止法测序步骤,一.测序DNA模板制备二.四种反应液的准备三.引物与模板退火四.延伸反应五.电泳六.读序,DNA测序方法,末端终止法：最常用。化学裂解法：研究DNA的二级结构，与蛋白质的相互作用。杂交测序法：DNA多态性分析。,一. 测序模板的制备,测序可分为单链测序与双链测序，对于
5、未知序列可采用单链测序，而对于已知DNA序列可采用双链测序。但不管单链测序还是双链测序，其测序反应都一样。 其中单链模板可通过将待测DNA片段克隆到噬菌体M13中或通过不对称PCR制备 ；双链模板可通过将待测DNA片段克隆到质粒DNA中或通过PCR扩增制备。所得模板DNA应通过纯化处理才能用于后继测序反应。,二. 测序引物的设计,测序所用引物一般采用通用引物，也可根据已有序列设计引物，引物一般有1530个碱基，应遵循一般引物设计原则。 引物设计原则： 1、G+C含量为4555%。 2、3端最好以A或C结尾，不要以T结尾。 3、引物长度以1530bp为宜。 4、引物本身不能形成二级结构。,三.
6、四种测序反应液的制备,测序反应液组成：反应缓冲液、DNA聚合酶、Mgcl2、引物、纯水、四种dNTP，分别在四个反应管中加入一种相应ddNTP。标记物：测序反应的标记物有核素和荧光染料。标记载体有引物、dNTP、ddNTP。现在应用较多的是将荧光染料标记于引物或ddNTP上，因核素对环境的污染而逐渐应用得比较少。但也可以不进行标记而采用银染系统检测。,四. 延伸反应,引物在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补配对原则逐步在引物的3端加上四种脱氧核糖核苷酸。四个反应管中的ddNTP随机地与dNTP竟争结合位点，于是引物延伸链随机终止在各个可能位点，形成一系列相差一个核苷酸的单链DNA分子。,五.电泳
7、与读序,反应产物与甲酰胺混和，并高温加热变性后，于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对于没有标记的测序反应，电泳完成后可用银染将DNA标记、拍照、读序。对于用核素标记的测序反应，按核素操作规程拍照。对于用荧光染料标记的测序反应，现有一些商业生物技术公司开发的测序仪可在电泳过程中进行检测。,末端终止法图示,ACGTTGCACGTA,A反应管AACGTTGCAACGTTGCACGTA,C反应管ACACGTTGCACGTTGCAC,G反应管ACGACGTTGACGTTGCACG,T反应管ACGTACGTTACGTTGCACGT,TGCAACGTGCAT,T泳道,化 学 裂 解 法,首先对待测DNA单链单侧末端
8、进行放射性标记，再分成45个反应体系，分别用不同的化学试剂处理，DNA片段分别于某一种或某一类碱基处断裂，而断裂的碱基随机发生于DNA片段上某种或某类碱基中的任何一个,且每一个DNA分子只有一处断裂点。电泳后，放射自显影得到相互错落的梯形图谱，即可读出DNA序列。,化学测序反应机理,G反应：硫酸二甲脂(DMS)使鸟嘌呤N7甲基化。A+G反应：甲酸使嘌呤环的氮质子化而使糖苷键被削弱，进而嘌呤环被吡啶取代。C+T反应：肼裂解嘧啶环，导致其脱落。C反应：在一定浓度的NaCl存在时，肼只对胞嘧啶起作用。 以上反应完成后，吡啶在加热条件下导致被修饰碱基处磷酸二酯键断裂。,化学测序法操作步骤,1.待测单链
9、DNA的纯化和标记2.碱基的特异性修饰3.碱基的裂解4.上样电泳5.测序图谱识读,5 *p GATCGGACCT 3,G反应,G+A反应,T+C反应,C反应,*GATCGGACCT*GATCGGACC*GATCGGAC*GATCGGA*GATCGG*GATCG*GATC*GAT*GA*G,化学裂解法的特点,优点：1、所测序列直接来源于所测DNA，避免了DNA复制中错误dNTP的掺入。2、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究DNA的二级结构及蛋白质与DNA的相互作用等。缺点：操作复杂，读序困难。,杂 交 测 序,杂交测序是以基因芯片为基础的一种测序方法，将一段DNA片段分解为
10、一系列相差一个碱基的八聚体，将这些八聚体做成基因芯片与待测DNA杂交，根据杂交结果拼凑出所测DNA序列。,杂交测序详解,TCACGATCCTTAGGCAC 测序模板AGTGCTAG GTGCTAGG TGCTAGGA GCTAGGAA CTAGGAAT TAGGAATC AGGAATCC GGAATCCG GAATCCGT AATCCGTG,Genechip,基 因 芯 片,Applied Biosystem 公司 310 型遗传分析仪介绍,ABI公司专业生产各种PCR仪和电泳仪，本次所介绍的ABI PRISM 310遗传分析仪为ABI公司生产的单毛细管电泳系统，由电泳系统、激光信号检测系统、
11、计算机分析系统等组成。能用于基因扫描、DNA测序分析等。,基因扫描 (Gene Scan),基因扫描可用于检测待测物种的有无、单链构象多态性分析(SSCP)、基因突变等检测。,DNA测序分析,ABI PRISM 310遗传分析仪可用于DNA测序分析，四种双脱氧核苷酸碱基带有四种不同的荧光染料，利用双脱氧末端终止法测序。经过一根盛有变性聚丙烯酰胺凝胶的毛细管电泳，长短不同的DNA片段依次通过激光检测窗口，由CCD摄像机收集荧光信号，再由机算机测序分析软件对所收集的信号进行分析。 测序速度高达200bp/小时，一个样品一次可测定700多个碱基。,激光,CCD摄像机,ddATP,ddTTP,ddGT
12、P,ddCTP,DNA测序仪的应用,1、基因组测序2、基因突变分析3、基因连锁图谱和指纹图谱4、基因表达5、疾病的基因诊断,DNA测序检测,亨廷顿病(Huntingtons disease，HD) 亨廷顿病是以神经系统退行性改变为主要特征的常染色体显性遗传病。1993年发现HD基因，并揭示IT15基因的不稳定突变，即IT15基因5端编码区CAG三个核苷酸的异常扩展性重复是HD的遗传学基础。,病例来源：江苏徐州HD家系 ：7例患者，30例HD风险者。浙江慈溪HD家系：1例患者，9例HD风险者提取受检者外周血白细胞基因组DNA，先进行PCR扩增IT15基因，接着进行DNA测序反应，,检 测 结 果
13、 IT15基因在正常人中其(CAG)的重复数呈多态性，其拷贝数在1326之间。 HD的IT15基因的(CAG)拷贝数均大于40，大多数为4550。,亨廷顿病发病预测 IT基因的(CAG)拷贝数的多少与亨廷顿病的发病年龄呈正相关，(CAG)拷贝数在4550时，发病年龄为40岁左右；(CAG)拷贝数在50以上时，其发病年龄在2030岁之间。,亨廷顿病的发病机制 亨廷顿病是由IT基因的(CAG)重复序列的重复数太多引起的，CAG可编码谷氨酰胺，由于CAG的重复数太多，则由CAG编码的谷氨酰胺在IT基因编码的蛋白质中大量积累，从而影响蛋白质的正常功能。,DNA测序在亨廷顿病中的应用 根据亨廷顿病的发病
14、机制，可以利用DNA测序技术进行亨廷顿病的预测和诊断。可抽取羊水细胞，提取其DNA后，用PCR扩增IT基因的目地片段进行测序，检测其(CAG)拷贝数的多少，根据CAG重复数的多少预测胎儿出生后患HD的风险系数，决定是否终止妊娠。,乙型血友病的DNA测序检测血友病可分为甲型血友病和乙型血友病两种血友病的临床症状相似，出血部位为肌肉、关节及深部组织，直到1952年才用凝血活酶生成实验(TGT)及部分凝血活酶时间(PTT)测定实验将两种血友病分开。,Y X正常男性,Y X血友病男性,X X正常女性,X X血友病女性,X X携带者女性,正常基因,血友病基因,目前研究发现导致乙型血友病发生的F基因功能障碍的基因突变种类繁多，大约有400种左右，由于乙型血友病基因较小，对乙型血友病可以测定基因的序列作出诊断。,从36例乙型血友病患者中共检出17位女性为突变基因携带者。检测出女性携带者后，可对该妇女开展产前诊断，如果发现了胎儿为血友病患者或血友病基因携带者，则可终断妊娠，阻断有害基因传代蔓延，做到优生优育。,临 床 意 义,DNA测序在临床上的意义,一、对于多基因的遗传病，可通过测定其相关基因的DNA序列后，针对不同基因的变异情况而采用不同的治疗方案，达到临床的个体化用药治疗。 二、及早发现遗传病，有利于优生优育。,
