1、,16.5.2酶免疫分析技术,应化1305宋宇韡 33,2,酶免疫技术的分类,克隆酶供体免疫测定,酶免疫分析技术,酶免疫组织化学技术,酶免疫测定技术,均相酶免疫测定,异相酶免疫测定,酶放大免疫测定技术,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验(ELISA),组织切片或其它标本中抗原的定位分析,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,一、均相酶免疫测定法,酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。,一、均相酶免疫测定法,基本原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。
2、,因此，不需对反应液中结合和游离的酶标记物进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。,二、非均相酶免疫测定法,基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离游离的和结合的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相酶免疫测定法。,酶联免疫吸附试验（ELISA）,一、基本原理,底物显色定性或定量的分析,包被将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,方法类型及反应
3、原理,（一）检测抗原的方法,将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。,1.双抗体夹心法,双抗体夹心法检测抗原,适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原,（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。,2技术要点,底物,（+）,双抗体夹心法测抗原,2.双位点一步法检测抗原,即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克
4、隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。,双位点一步法检测抗原,在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗,3.加酶作用的底物显色,2.加待检抗原和酶标抗体,1.已知抗体包 被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（+）,3.加酶作用的底物不显色,2.加待检物（无抗原）和酶标抗体,1.已知抗体包 被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（-）,Y,Y,Y,双位点一步法测抗原,如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）
5、”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。,注意事项,E,底物,固相抗体,标本（抗原浓度高）,酶标抗体,3.竞争法检测抗原,酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。,酶标抗原,竞争法检测抗原,（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶
6、标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。,技术要点,竞争法测抗原,（二）检测抗体的方法,将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,1.间接法,间接法检测抗体,酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG），因此该法只需要变换固相抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性,间接法测抗体,2.双抗原夹心法,将已知抗原包被固
7、相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,同双抗体夹心法。,技术要点,双抗原夹心法检测抗体,4.加酶作用的底物 不显色,双抗原夹心法测抗体,3.竞争法检测抗体,同竞争法结合抗原。,HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。,1原理,（1）竞争法检测HBcAb：将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,2技术要点,竞争法检测HBcAb,3.加
8、酶作用的底物显色,3.加酶作用的底物显色,2.加待检抗体 和酶标抗体,1.已知HBcAg包 被载体,（+）,Y,Y,Y,Y,Y,E,2.加待检物（无抗体）和酶标抗体,1.已知HBcAg包 被载体,（-）,Y,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,E,E,E,E,竞争法检测HBcAb,（2）竞争法检测HBeAb：将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。加入酶标HBeAb，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,竞争法检测HBeAb,竞争法检测HBeAb,方法评价,ELISA具有操作简便、快速、敏感性高、特
9、异性强、实验设备要求简单、应用范围广泛、无反射性同位素污染等优点。发展最快、应用最广，普及。,1病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊断。2蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。3药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。,酶免疫测定的应用,酶增强免疫测定技术EMIT,将半抗原（或小分子抗原）与酶结合成酶标半抗原，采用竞争法测定半抗原，即样品中待测半抗原复合物和酶标半抗原与相应抗体竞争结合，形成待测半抗原复合物和酶标半抗原复合物。,原理,当酶标半抗原与抗体结合后，抗体与所标记的酶密切接触，使酶的活性中心不受影响，其活性得以发挥，通过加底物测定反
10、应系统中酶活性。待测半抗原含量与酶活性成正比，即待测半抗原越多，酶活性越高。通过建立标准曲线，可以求得样品中半抗原的含量。该技术主要用于检测小分子或半抗原，在药物检测中应用最多。,克隆酶供体免疫测定技术CEDIA,克隆酶供体免疫测定技术（CEDIA）是利用充值DNA技术，制备半乳糖苷的两个片段；羧基端的大片段称为酶受体（enzyme acceptor，EA），氨基端的小片段称为酶供体（enzyme donor，ED）。这两个片段本身均无酶活性，但EA和ED可以聚合成具有活性的酶。,原理,CEDIA反应模式为竞争法。测定原理为标本中的抗原与ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活力。酶活力的大小与样品中抗原含量呈正比。CEDIA主要用于药物和小分子物质的测定。,
