1、-酪啡肽-7功效学研究进展,营养与食品卫生M150879吴鹏,目录,一、-酪啡肽的简介（1） 酪啡肽的定义（2） -酪啡肽的发现（3） -酪啡肽的结构特征二、 -酪啡肽-7的制备（分离、纯化、鉴定）三、 -酪啡肽-7的主要生理功能及研究进展四、展望,酪啡肽的定义,酪啡肽又称酪蛋白吗啡、酪蛋白阿片肽、外啡肽，是酪蛋白在消化酶作用下释放的，能被机体直接吸收，具有多种生物学功能的乳源生物活性肽之一。是重要的乳源阿片肽。它具有行为调节及免疫调节作用，能抑制肠道运动，促进胰岛素分泌，对产乳及内源性器官发育生长因子有协同作用。 酪蛋白是乳中最重要的成分。乳源生物活性肽是酪蛋白在消化酶作用下释放的，能被机体
2、直接吸收，具有多种生物学功能。其中酪啡肽是最重要的乳源生物活性肽之一。-酪啡肽-7(beta-asomor-phin-7p）是从牛乳-酪蛋白的酶解产物中分离出来的具有阿片活性的七肽物质，为-酪蛋白第60 -66氨基酸残基片段。,-酪啡肽的发现,1979年，Brantl等在豚鼠回肠纵肌肠肌中分离到一个牛乳酪蛋白的酶解产物，其是一个含有7个氨基酸残基的寡肽，命名为-酪啡肽-7，序列为Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-lle，为牛-酪蛋白第60-66位氨基酸残基片段，它具有很高的阿片活性，能够与u型阿片受体结合。后来人们又发现了-酪啡肽-4、 -酪啡肽-5、 -酪啡肽-6、 -酪啡肽-
3、8、 -酪啡肽-11。,-酪啡肽的发现,-酪啡肽的结构特征,牛-酪啡肽是由牛-酪蛋白分解产生的含有3-11个氨基酸的多肽，都是以牛-酪蛋白的第60位的酪氨酸作为起始氨基酸;人的-酪啡肽的结构和牛的非常相似，在N端都具有Tyr-Pro-Phe（酪氨、脯、苯丙）的序列。目前科学家发现了多种长度的-酪啡肽，其主要包括-CM-4,-CM-5 ,-CM-6,-CM-7 ,-CM-8和-CM-11，研究表明:对于所有含有不同数量氨基酸残基的-酪啡肽，在N-末端含有相同的氨基酸序列Tyr-Pro-Phe，这对于保持一酪啡肽的生物活性是非常重要的。在酶促降解方面一酪啡肽是非常稳定的，其能够抵抗多种蛋白酶(如胃
4、蛋白酶和胰蛋白酶)的降解，这种特性与其肽链中富含脯氨酸有关。,-酪啡肽-7的制备,人和动物乳被认为是最接近完美的食品，酪蛋白是乳中最主要的蛋白，占乳蛋白的80%左右。这些生物活性肽本身以非活性状态存在于蛋白质氨基酸序列之中，当在一定条件受蛋白酶作用下，可形成有活性的生物活性肽。一酪啡肽-7是从牛乳-酪蛋白的酶解物中分离出来的具有阿片活性的一个七肽物质。,-酪啡肽-7的制备,一、酪蛋白酶解方法：称取600mg酪蛋白，加双蒸水溶解，另加少量NaOH助溶;待酪蛋白充分溶解后加少量HC1，定容。称取胃蛋白酶，使酶与底物浓度之比为1:25;于37水浴保温，实验组保温时间分别作用60min, 90min,
5、 120min, 150min;酶解结束后加入15%三氯乙酸终止反应，取上清，用NaOH调整pH至7.1。,二、反相高效液相色谱（RP-HPLC）鉴定酪蛋白酶解产物中的-CM-7方法：1.待测液的预处理:取各时间点酪蛋白酶解液的上清液2m1，经0.22um微孔滤膜过滤，用于RP-HPLC分析。2.用缓冲液平衡层析柱，待运行结果显示稳定的基线时，分别取各时间点的20ul酪蛋白酶解上清液手工进样。3.检测波长215nm，流速0.75，线性洗脱运行30min。4.将加样酪蛋白酶解上清液换成-CM-7标准品，制定标准峰。5.内标法检测:在待测样品中加入标准-CM-7溶液，用以增强待测样品的分析结果。,
6、三、葡聚糖凝胶 （Sephadex）G-15凝胶层析分离纯化酪蛋白酶解上清液结果：120min酪蛋白酶解上清液，经葡聚糖凝胶G-15层析结果图，在215nm消光读数，绘制的洗脱曲线。收集不同组分洗脱液，按管号为6-19, 20-35, 36-50，51-73, 74-89, 90-120加以合并，得到6个组分。其中第六组分(箭头所指)中最有可能含有-CM-7等小分子物质。,三、 -酪啡肽-7的主要生理功能及研究进展,酪啡肽的主要生理功能：1.对胃肠道运动的影响(降低收缩力，抑制葡萄糖吸收等)2.对免疫功能的影响（促进免疫器官发育等）3.对生殖内分泌的影响（影响动物发情、排卵、性成熟等）4.对采
7、食的影响（增加高脂饲料采食等）5.镇痛、镇静作用（作用同吗啡，镇静止痛、诱导睡眠）6.对神经系统的作用（促进神经母细胞瘤神经细胞的生长）7.其它作用（导致健忘症，抗焦虑）,研究进展,（1）Brantl等发现-酪啡肽-7能够显著降低豚鼠回肠收缩力（2）谈寅飞等体外研究发现-酪啡肽-7可促进仔猪胃窦分泌胃泌素（3）宗亚峰的研究发现-酪啡肽-7能够抑制小肠对葡萄糖的吸收（4）凌明亮等还发现-酪啡肽-7能够增加小肠对D一木糖的吸收能力（5）顾芳等人研究发现-酪啡肽-7能够防止酒精性脂肪肝（6）潘翠玲发现饲喂-酪啡肽-7能够促进仔猪免疫器官和组织的发育（7）皮下注射-酪啡肽-7能够引起类似组胺引起的丘疹
8、和炎症反应（8）研究发现外周注射-酪啡肽-7能够刺激大鼠增加高脂饲料的采食（9）印虹等人研究发现乳源-酪啡肽-7具有降血糖作用（10）腹腔注射-酪啡肽-7能够显著降低大鼠尾夹疼痛反应（11）-酪啡肽-7及其衍生物也能够增加婴儿睡眠（12）Han等研究发现-酪啡肽-7能够减轻糖尿病大鼠心脏的损伤（13）实验证明给白化的大鼠饲喂-酪啡肽-7能够产生抗焦虑的作用,（6）潘翠玲发现饲喂-酪啡肽-7能够促进仔猪免疫器官和组织的发育,一、材料与方法1.饲养动物 将来源于日龄、体质量相近的12头三元杂交仔公猪随机分为对照组和试验组，每天喂料4次，自由饮水，以红外灯保温，室内温度252湿度81% -85%，试
9、验前及试验过程中疫病防治均按该场的常规方案进行试验组的仔猪于21日龄断乳，与母猪隔离，饲养在保育室，在饲喂早期断乳仔猪料的基础上，每头每天添喂10umol/ L-酪啡肽-7的溶液20 mL(分2次喂给)，连续添喂10d，对照组的仔猪随母猪饲养在产仔室继续吃母乳到28日龄时断乳，移入保育室饲养，饲喂与试验组相同的仔猪料，2组均于32日龄捕杀。,2.样品处理： 收集胃和十二指肠内容物，按1:1的比例用生理盐水将内容物稀释，4 3 000 r/min离心15 min，取上清液测相关酶的活性;取2 cm X 2 cm的胃窦、截取十二指肠的中部、空肠前段(空肠的前1/ 3)的中部、回肠的中部各2cm，用
10、生理盐水冲去内容物，置于Bouin氏液固定，常规石蜡切片(厚度为6 um) , HE染色，树胶封片用Olymps显微镜观察并照相。3.检测项目 应用Image-processing-plus图象分析系统测量肠绒毛长度、绒毛宽度、腺隐窝深度和肠壁肌层厚度。测定仔猪胃内容物的胃蛋白酶总活性，测定仔猪十二指肠内容物的淀粉酶活性、脂肪酶活性、胰蛋白酶总活性。,4.数据处理 采用Excel分析软件，平均数值以X平均S表示，用t检验进行显著性分析。,实验数据：,实验结果分析：,1.与对照组相比，试验组的仔猪胃窦粘膜厚度比对照组增厚61. 98% 。 2.与对照组相比，试验组的仔猪十二指肠绒毛长度比对照组增
11、长34.47%，绒毛宽度与对照组的相近，肠壁肌层的厚度低于对照组,肠隐窝深度加深，而肠绒毛长/隐窝深的比值比对照组的大16. 98%。 3.与对照组相比，添喂-酪啡肽-7溶液的仔猪，十二指肠内容物胰蛋白酶总活性比对照组的低24.39%(P 0.05)，而胃蛋白酶总活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性均极显著低于对照组。所以说-酪啡肽-7确实有促进断奶仔猪免疫器官发育的功能。,返回,（9）印虹等人研究发现乳源-酪啡肽-7具有降血糖作用,1.动物分组与处理 健康成年SD大鼠16只，自由采食，饮水，预饲1周后，随机分成对照组和-CM-7组。分别灌喂生理盐水(对照组)、7.5 X 10(-6) mol/L(-
12、CM-7组）每天两次，每次1 mL，间隔12h，连续灌喂30天。期间每隔5天断尾采血，动态观察血中葡萄糖浓度的变化。2.样品采集及处理 在试验的第30天(禁食12h)，宰杀大鼠，静脉采血，血液放置1h后，以3000 rpm离心15 min，分离血清并吸取分装，-20保存备用; 取肝脏、右侧腿肌，放入自封袋，-20保存; 取出小肠，用冰冷生理盐水冲洗，翻转小肠后再漂洗，将洗净的小肠用吸水纸吸干表面的液体，用载玻片轻刮下小肠豁膜，-80保存备用。,3.指标测定（1）血液中葡萄糖浓度测定 按试剂盒说明书氧化酶法测定血清中葡萄糖浓度。具体取血清10uL，加入1 mL葡萄糖测定液，37水浴15 min后
13、，冷却，在波长505 nm处测定其OD值，根据计算公式计算血糖值。 G =OD测定管/OD标准管*5.55mmol/L（2）肝糖原、肌糖原含量的测定 按试剂盒说明称取肝脏、肌肉各80 mg左右，按照体积比1: 3加碱液后沸水煮20min，流水冷却，加蒸馏水稀释成1%肝脏，5%肌肉的糖原检测液。取检测液100uL,显色液2 mL，置沸水煮5 min，冷却，在波长620 nm处测OD值，根据下面计算肝糖原二测定管OD值/标准管OD值、标准管含量、样本测定前稀释倍数(100) *10/1.11肌糖原二测定管OD值/标准管 OD值x标准管含量x样本测定前稀释倍数(20) *1011.11,（3）血清中
14、胰岛素、胰高血糖素水平的测定 胰岛素测定:取100uL血清，加入豚抗一Ins.抗体100 uL, 125I- Ins. 100 uL，混匀放置16-18 h，加入Ins，驴抗豚免疫分离剂500uL，充分混匀后，室温放置15 min, 3500rpm离心15 min，吸弃上清，测各管沉淀物的放射性计数(cpm)。 胰高血糖素检测:取200uL血清，加入豚抗一Glu.抗体100uL，混匀室温放置4 h,加入125I- Glu. 100 .L，混匀放置16-18 h，加入Glu.驴抗豚免疫分离剂500uL，充分混匀后，室温放置15 min, 3500 rpm离心15 min，吸弃上清，测各管沉淀物的
15、放射性计数(cpm )。（4）参照戴岳方法测定肠黏膜a-葡萄糖苷酶活性（5）将刮取的肠囊黏膜，按照试剂盒说明检测其Na-K-ATP酶活力。,（6）小肠上皮黏膜SGLT -1 mRNA表达分析 提取样品总RNA反转录设计目的基因引物序列分析SGLT -1 mRNA的RT- PCR分析（重复两次）（7）数据处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计，差异显著性检验采用独立样本t检验和单因子方差分析(Oneway ANOVA， LSD )。所有数值以平均值士标准误(MeanSE)表示。,实验结果：,结论：与对照组相比，灌喂-CM-7组大鼠血糖水平略低于对照组，统计学分析在25天时差异显著，其余差异不
16、显著。,实验结果：,结论：灌喂-CM-7组大鼠肝糖原含量与对照组比较差异不显著(p=0.73 );肌糖原含量与对照组相比，极显著降低(p=0.001)。即-CM-7能够降低肌糖原的含量。,实验结果：,结论：灌喂-CM-7组大鼠胰岛素、胰高血糖素含量与对照组相比，差异均不显著。即-CM-7对血糖含量的影响不是直接通过糖相关激素影响的。,-CM-7对大鼠小肠站膜SGLT -1 mRNA表达的影响(n=8) A为RT-PCR电泳图,B柱状图为SGLT-1与-actin mRNA（信使）的灰度比分析统计结果,试验结果提示，-CM-7可以下调小肠黏膜SGLT-1 mRNA的表达。,总结：,连续灌喂-CM
17、-7大鼠血糖浓度较灌喂生理盐水有降低，但二者之间差异不显著(p=0.35 ); 肝糖原、胰岛素、胰高血糖素、a-葡萄糖普酶活力、Na+-K+-ATP酶活力二组之间均无明显差异; 试验组肌糖原含量低于对照组(p=0.001 ) ; SGLT 1mRNA表达显著低于对照组(p=0.02 )。结论: -CM-7具有辅助降血糖作用，其机制可能是通过下调小肠黏膜上皮SGLT- 1 mRNA的表达，减少肠道葡萄糖的转运，并增加肌糖原的消耗。,生物活性肽的研究给动物生理生化、营养生理学、生物医药及食品科学等学科提供了一个广泛的研究领域，有关酪啡肽的生理生化研究是一个很有前景的研究领域，但尚需做很多深入、细致的工作，如参与调节酪啡肽吸收利用的因素，酪啡肽具有的其他生理作用及机制，利用酪啡肽的研究成果转化成临床药品或辅助治疗的药剂。 摘自印虹老师文章1.制成降血糖、降血脂药物。（宋晓丹实验）2.制成精神科药物抗焦虑药。（张伟实验）3.制毒。（个人观点，仅供参考）,展望：,Thank you ！谢谢观赏！,了解的很粗浅，希望课后能和老师、同学有更多的交流机会，共同学习！,
