1、毒理学实验,实验一 实验动物的一般操作技术,一、目的,二、内容（一）实验动物的选择 1、物种的选择：啮齿类、非啮齿类 基本原则：代谢、生化、毒理学特征与人最接近的自然寿命不太长的易于饲养和实验操作的经济且易于获得的,2、品系的选择：遗传学控制分类近交系：纯品系，经至少连续20代的全同胞兄妹之间或亲代与子代之间交配培育而成的动物杂交群：F1代，两个不同近交系之间进行有计划的交配.杂交所产生的第一代动物，即F1代动物封闭群：5年内，随机交配。一个种群动物位于固定地点，5年以上不从外部引进任何新种,仅在群内随机交配繁殖遗传均一性：一种毒物固定使用同种品系,3、微生物学和寄生虫控制的选择级：普通动物，
2、开放系统饲养级：清洁动物，屏障系统饲养级：SPF动动，屏障/隔离系统饲养级：无菌动物，隔离系统饲养,4、个体选择性别：年龄：急性、慢性以体重估计：组内、组间差异生理状态：雌-未产未孕，避免妊娠、激素影响健康状况：健康动物健康动物辨认：,健康动物辨认：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速、反应灵活，食欲及营养状况良好。(1)眼：明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。(2)耳，耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。(3)鼻：无喷嚏，无浆性粘液分泌物。(4)皮肤：无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。(5)颈部：要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。(6)消化道：无呕吐、腹泻，粪
3、便成形，肛门附近被毛洁净。(7)神经系统：无震颤、麻痹。若动物(大鼠、小鼠)出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆应放弃该动物。(8)四肢及尾：四肢、趾及尾无红肿及溃疡。,（二）动物性别鉴定(1)大鼠、小鼠：主要依肛门与生殖孔间的距离区分，间距大者为雄性，小者为雌性。成年雄鼠卧位可见到辜丸，雌性在腹部可见乳头。(2)豚鼠；用一只于抓住豚鼠颈部，另一只手扒开靠生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性器官的突起，雌性动物则显示三角形间隙，成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。,（三）动物抓取正确地抓取固定动物，既不损害动物健康、不影响观察指标，又防止被动物咬伤(1)小鼠：先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上向后拉
4、，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。 尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。,(2)大鼠：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情凶猛，不易用袭击方法抓取。为避免咬伤，可带上帆布或棉纱手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中。,(3)豚鼠：豚鼠胆小易惊，在抓取时要稳、准、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，另一只手托住臀部
5、即可。(4)兔：用右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，让其体重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取双耳或抓提腹部。,（四）实验动物称重、编号、标记项圈耳缘孔口标记：染色法：苦味酸、品红,耳缘孔口标记：用耳号钳在耳上打洞或者用剪刀在耳边缘剪缺口，左耳为十位，右耳为个位。（五）动物随机分组：随机数字表,（六）染毒途径和方法经口（胃肠道）染毒喂饲：不易挥发、不易水解、无异味、不影响营养吞咽胶囊：灌胃：灌前禁食空腹，不饮水，灌胃容积0.10.2ml/10g小鼠、大鼠或豚鼠：左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食管。针插入时应无阻力，
6、若感到阻力或动物挣扎，应立即停止进针或将针拔出，以免损伤或穿破食管及误入气管。,经呼吸道染毒静式吸入动式吸入气管内注入,经皮肤染毒斑贴法（家兔）被毛的去除：剪毛、拔毛、脱毛浸尾法（大、小鼠）注射染毒：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、皮内注射,（七）生物标本采集 1.血液采集：大、小鼠鼠尾采血法眼眶静脉丛采血法腹主动脉或股动(静)脉采血法断头采血法家兔耳缘静脉采血法心脏采血法,实验动物安全采血量,2.尿液、粪便收集：代谢笼,（八）动物处死脊椎脱臼法断头法急性大失血法击打法麻醉致死法,麻醉后急性放血法空气栓塞法化学药物致死法开放性气胸法,微核实验动物染毒,阴性对照组：生理盐水阳性对照组：环
7、磷酰胺40-60mg/kg高剂量组：敌敌畏20mg/kg中剂量组：敌敌畏10mg/kg低剂量组：敌敌畏5mg/kg,实验二急性经口毒性试验,一、目的掌握LD50 计算方法和急性毒性分级标准熟悉经口灌胃技术了解急性毒性试验的设计原则,急性毒性、急性毒性分级标准,急性毒性：一次或多次接触，短时间产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变，大体形态改变以及死亡效应等。农药的急性毒性分级：低、中、高、剧毒,LD50计算方法,改良寇氏法：计算简便，准确率高，常用霍恩法序贯法Bliss法,改良寇氏法要求,每组动物数相等各剂量组组距呈等比级数死亡呈正态分布最低剂量组死亡80%,二、原理,健康动物按体重随机分组一
8、次或多次经口给药观察中毒特征或死亡剂量-反应关系求出LD50 毒性分级,三、材料与试剂,动物：昆明种小白鼠器材：注射器、灌胃针、见到、镊子、试剂瓶、标签笔、移液枪等（课下交还）试剂：敌敌畏，苦味酸,四、步骤,动物选择剂量设计：5-8个剂量（一般不设对照组）动物称重、编号、标记受试物配制灌胃：0.1-0.2ml/10g体重观察：急性毒性试验原始记录,剂量设计：预实验：文献LD50=50-92mg/kg设置400、200、100、50、25mg/kg 五个剂量，每剂量3只鼠。找出LD100和LD0 组距i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1）n是实验组数；i是正式实验中两个相邻剂量组的剂量对
9、数之差,A: lg200=2.301B: lgx=2.301-iC: lgy=2.301-2iD: lgz=2.301-3iE: lgw=2.301-4iF: lg50=1.690,1：k系列稀释法最大剂量组浓度C1 （母液浓度）C1=200mg/kg=2mg/10g0.2ml/10g2mg/0.2ml=10mg/ml每组最大体积m=20ml（设每只鼠需2ml）k：相邻两组剂量之比=64.89/85.981=0.75V总=m/（1-k）=81.53ml（各组母液和）,敌敌畏原液浓度：1400mg/ml稀释成10mg/ml，81.53ml的母液1400mg/ml*Vx=10mg/ml*81.53
10、ml Vx=0.582ml V水=81.53-0.582第1组 20ml第2组 剩余母液+20ml水混匀后取20ml以此类推,LD50计算：LD50及95%可信区间,计算公式,m=Xk-i(p-0.5),m：lgLD50 i:相邻两剂量组对数值的差 Xk：最大剂量的对数值P：死亡率 q:存活率 n：每组动物数p=各剂量组死亡率总和,五、评价：毒性分级、毒性特征六、讨论：,实验二皮肤刺激性/腐蚀性试验（豚鼠）,试验目的,确定化学物对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度，为制定防护化学物对皮肤的刺激保护措施提供依据。,皮肤刺激性(Dermal Irritation)：皮肤涂敷受试样品后
11、局部产生的可逆性炎性变化。皮肤腐蚀性(Dermal Corrosion)：皮肤涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损伤。,试验的基本原则,将受试物一次(或多次)涂敷于受试动物的皮肤上，在规定的时间间隔内，观察动物皮肤局部刺激作用的程度并进行评分。采用自身对照，以评价受试物对皮肤的刺激作用。急性皮肤刺激性试验观察期限应足以评价该作用的可逆性或不可逆性。,强酸或强碱物质如pH2或pH11.5，由于可预见其腐蚀特性，不必做本试验；若已知受试样品有很强的经皮吸收毒性（LD50200mg/kg bw）的物质不必进行本试验；,试验方法,1、受试样品液态受试样品采用原液或人类实际应用浓度固体受试样品经研磨，过
12、100目筛后用水或适当的赋形剂（如凡士林、阿拉伯树胶、乙醇和水、羧甲基纤维素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和矿物油等）按一定比例调制，以保证与皮肤充分接触。,2、实验动物和饲养环境,首选健康成年白色家兔，其次为白色豚鼠。至少需要4只健康成年动物（雄性和/或雌性均可）。每只动物相邻的未处理的皮肤可作为对照。 每只单笼饲养，试验前动物要在实验室中适应3d。常规饲料喂养，自由饮水,3、剂量设计受试样品0.5ml(g)，均匀涂布于受试部位。如受试样品难以获得，或易产生全身毒性等原因，用量可适当减少。但为了试验的一致性，测试面积应力求相等。,4、试验步骤,1）试验前准备试验前24h，将实验动物脊柱两侧毛剪去
13、或剃掉，不可损伤表皮，去毛范围左右各3cm3cm。24h后，选择皮肤健康完整无损的动物进行试验。不应在长有浓密岛状毛的部位进行受试样品试验。,2） 染毒受试样品0.5ml(g)直接涂布在皮肤上，用二层纱布（2.5cm2.5cm）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，敷用时间为4h。,对化妆品产品而言，可根据人的实际使用和产品类型，延长或缩短敷用时间。对用后冲洗的化妆品产品，仅采用2 h敷用试验。试验结束后用温水或无刺激性溶剂清除残留受试物。,如怀疑受试样品可能引起严重刺激或腐蚀作用，可采用分段试验，将三个涂布受试样品的纱布块同时或先后敷贴于
14、一只家兔背部脱毛区皮肤上，分别于涂敷后3min、60min和4h取下一块纱布，皮肤涂敷部位在任一时间点出现腐蚀作用，即可停止试验。,3）观察期限观察时间的确定应足以观察到可逆和不可逆刺激作用的全过程，一般不超过14d。于清除受试样品后的1、24、48、72h分别观察给予受试样品部位的皮肤反应，按表1进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24、48和72h各观察时点最高积分均值，按表2判定皮肤刺激强度。,5、试验报告,试验报告应以表格形式总结，包括如下内容：受试物名称、理化性状、配制方法和用量。必要时说明pH值实验动物种属、品系、性别、体重和来源(合格证号和级别)实验动物饲养
15、环境：饲料来源、室温、相对湿度、动物房合格证号每个动物在每一观察时点的皮肤刺激反应积分具体描述除刺激性以外的其它毒性作用结论,8 试验结果的解释,急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔和豚鼠在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。试验中使用封闭式接触是一种超常的实验室条件下的试验，在人类实际接触化学品过程中很少存在这种接触方式。,附：多次皮肤刺激性试验步骤1 试验前将实验动物背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为2cm3cm，涂抹面积2.5 cm2.5cm。2 取受试物约0.5mL(g)涂抹在一
16、侧皮肤上，当受试物使用无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹1次，连续涂抹14d。从第二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。一小时后观察结果，按表1 评分，对照区和试验区同样处理。,结果评价：按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表2判定皮肤刺激强度。,DDV：LD50：5080 mg/kg(大鼠经口)；75-107，113 mg/kg(大鼠经皮)；LC50：15mg/ (大鼠吸入，4h)二甲苯：LD50：5000mg/kg（大鼠经口）；LC50：1947mg/m3（大鼠吸入）;轻微粘膜刺激。引起皮肤发红。家兔经皮：500mg/24h，中度刺激甲醛：急性毒性
17、：LD50800mg/kg（大鼠经口），2700mg/kg（兔经皮）；LC50590mg/m3（大鼠吸入）；人吸入60120mg/m3，发生支气管炎、肺部严重损害；人吸入1224mg/m3，鼻、咽粘膜严重灼务、流泪、咳嗽；人经口1020ml，致死。,实验三小鼠骨髓细胞微核试验,一、目的：掌握小鼠骨髓PCE微核测定方法二、原理 染色体断裂染色体完整性 纺锤丝受影响染色体分离改变有核细胞：难与核的分叶鉴别红细胞：最后一次分裂后将主核排出（PCE） PCE 24小时NCE（比PCE小1/5） 灰蓝色 桔红色,三、材料、试剂试剂：受试物、阳性物、小牛血清、染液等动物器材,四、步骤动物选择：雌雄各半剂量
18、选择：阴性、阳性对照，3-5个剂量组高、中、低剂量组： 1/5、1/10、1/20 LD50最高剂量组：动物分组、编号、标记动物染毒：环磷酰胺（阳性对照实验）腹腔注射，20mg/kg，每组2只鼠 染毒次数：两次或多次染毒，每天染一次,涂片、固定、染色：脱臼处死胸骨或股骨（股骨连接骨盆和小腿骨，取股骨保留股骨头和膝盖骨）肌肉软组织用纱布包上去除剪掉两端，移液枪吸血清（预热）1ml放离心管中1ml注射器吸血清，镊子夹股骨冲洗骨髓细胞，1端冲洗3-5次，2端共冲洗6-10次1000rpm离心10min倒掉上清，留0.2-0.3ml上清推片晾干甲醇固定30-60s吉姆萨染色10min,吉姆萨工作液：蒸
19、馏水=1:9染色缸50ml染色后冲洗无细胞的一侧，显微镜观察PCE镜检计数：PCE/NCE 200个 PCE微核率 1000个,五、结果、统计分析与结论 阴性？ 阳性？,急性眼刺激试验,实验目的：掌握急性眼刺激试验原理、设计的基本方法、内容及思路，操作方法，了解刺激强度判断标准，结果判定。实验原理：用于评价受试物对哺乳动物眼睛是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度。将受试物滴入或涂入动物一侧眼结膜囊内，另一侧用赋形剂作为对照。在停止接触后的不同时间观察角膜、虹膜及结膜的反应情况，根据评分标准判断受试物对眼刺激的强度。,（1）选择家兔，称重、编号，检查动物双眼，有无异常。3-4只/组（我们1只/组）（
20、2）染毒：采用同体自身对照，轻轻拉开实验动物一侧眼睛的下眼睑，将配好的药物0.1ml滴入或涂入一侧眼结膜囊内，另一侧用赋形剂作为对照，给药后使眼睛被动闭合一段时间后，用生理盐水冲洗（规定84消毒液被动闭合时间为4s，30s后进行冲洗，1h后观察；农药被动闭合时间为1min，24h不做冲洗，1h后观察）,（3）刺激反应观察：1h、24h、48h、72h，肉眼观察家兔眼角膜、虹膜及结膜的损伤情况。如72h内未出现刺激反应，即可终止试验。若有刺激反应发生，要继续观察损伤的经过及其可逆型，观察期最长可至21天。（4）结果分析与评价：根据结膜（充血状态、水肿、分泌物）、角膜（浑浊、角膜受损损害）、虹膜反应对化学物刺激强度评分标准进行评分，并对眼刺激强度进行评估。,
