1、江西省医学检验质量控制中心 万本愿,临床形态学质量控制,临床形态学检查的范畴,1、骨髓细胞形态学检查2、血液细胞常规涂片形态学检查3、尿有形成分涂片检查4、细菌直接涂片检查5、脑脊液、浆膜腔积液细胞形态学检查6、各种分泌物涂片细胞学检查7、其他检查（如寄生虫检查）,一、血细胞形态学质量管理,1、概述 2、血细胞形态学质量控制 3、血细胞形态学检验存在的问题 4、细胞形态学检查质量管理的现状,1、概述 质量控制伴随着各种高端科技在检验医学中的不断应用，有力的确保了临床检验的准确性和有效性。为患者疾病的快速诊断及快速治疗提供了可靠的依据。随着社会的进步，时代的发展以及患者保健意识的提高，对医学检验
2、也提出了更高更优的要求，因此，注重质控的分析，已经是必然的趋势。组织与开展临床实验室细胞形态学的质量控制、 质量评价活动，对促进与提高我省血液细胞学检验的质量和水平有重要作用。,骨髓细胞形态学检查是血液细胞形态学研究和血液病诊断的主要方法，根据骨髓涂片观察细胞数量和质量的变化，可以反映大多数血液病的病变状况。全面质量管理是对临床检验全过程进行标准化管理，质量控制是全面质量管理的重要环节，是检验结果准确、及时、有效的保证。质量控制又可分为室内质量控制和室间质量评价。由于各实验室所用的仪器、试剂、方法、检验人员素质的不同，检测结果往往差异较大，各实验室的结果缺乏认同性，往往为临床诊疗工作带来负面影
3、响，因此加强包括从采集标本到发出报告的全面质量管理有十分必要的意义，即做好分析前、分析中和分析后的质量管理非常重要 。,2、血细胞形态学质量管理,分析前分析中分析后,1、人员2、建制3、仪器、设备、试剂4、实验方法5、患者6、申请单7、玻片8、取材部位9、涂片10、送检,1、形态学特征问题2、染色3、分类4、组化5、报告,1、存档2、反馈,1、参加室间控制的必要性2、血细胞形态学图像的建立3、计算机网络的建立4、评分标准的建立,室内质控室间评价,分析前质量管理人员,形态学检验专业人员应具有高的素质，较高的形态学检验水平，全面的临床与血液学及有关边缘学科知识。而目前我省从事血细胞形态学检验技术人
4、员水平参差不齐，部分人员未参加过专业培训就从事该检查工作。从事血细胞形态学检验人员上岗前应该接受正规系统培训。针对上述情况，我省在2012年举已办了两期血细胞形态培训班，并授予上岗合格证书。,分析前质量管理建制,多数医院由检验科临检室承担血液涂片和骨髓细胞形态分类检验。部分三级医院设有专门实验室，如血液研究室、细胞室，有的医院则由病理科兼任。由于隶属关系不同，非属检验科室一般不会参加检验中心和检验学会组织的学术活动和质量控制活动，给血细胞全面质量控制管理和参与均带来不便。因此，所有相关科室均应参加质量控制活动。,分析前质量管理仪器、设备、试剂,实验室必须提供进行检验服务所需仪器、设备和相应的环
5、境条件，目前省内各实验室仪器设备、所有试剂均不统一。参加血细胞全面质量控制后，要逐渐使用统一标准的实验室仪器设备和各种所需的试剂。细胞分析仪采集的图像一定要有代表性，要求细胞图像清晰和真实，不能随意扩大或缩小细胞的大小。,分析前质量管理实验方法,血细胞化学染色方法不同有可能导致实验结果不一致。参加血细胞全面质量控制后，要求按中华人民共和国卫生部医政司主编全国临床检验操作规程（第3版）有关检查方法参照执行。,分析前质量管理患者,初诊患者最好在使用药物治疗前进行血细胞形态学检查。骨髓采集标本前，对于患者心理的紧张和压力，医院应事先做好心理疏导，做好解释工作，以求双方配合，顺利完成穿刺工作。骨髓穿刺
6、无须空腹，短期时间内饮食不会引起血细胞形态质与量的改变。,分析前质量管理申请单,血细胞形态学检验是结合临床等资料进行相互参考，印证得出正确结论的过程。要求临床医生详细、准确地填写，如脾亢、淋巴结肿大、骨痛等临床资料，以提高细胞形态学诊断的参考意义,分析前质量管理玻片,载玻片的厚薄，清洁光滑和陈旧程度都会影响细胞形态学检查的结果，推荐使用11.2mm厚度：25.476.2mm长度的载玻片。新玻片表面有游离碱质，必须使用1mol/L HCI浸泡24h后再用清水彻底清洗、干燥后备用。旧玻片用含氯消毒剂浸泡24h后加入合成洗涤剂煮沸20min，再用热水将血膜洗去，用清水冲洗干净，干燥备用。必要时，可将
7、其用95%乙醇浸泡1h，脱净载玻片油脂，用蒸馏水洗净后，干燥备用。,分析前质量管理取材部位,血涂片采用静脉血或手指血进行推片，骨髓血细胞涂片由于骨穿操作不当或者定位有偏差都会直接对检验结果造成影响，经验证明最佳的骨穿部位应选择在髂后上棘，如个体情况需要亦可选择在髂前上棘或者胸骨。所抽取的骨髓量应严格控制在0.2ml以内。,分析前质量管理涂片,一张良好的涂片，要求厚薄适宜，体尾分明、边缘整齐，血细胞分布均匀。膜长度占载玻片2/3左右，推片厚度应适当参考外周血计数，如白细胞计数升高明显和外周血分类出现幼稚细胞者，应当适当推薄片。而三系减少患者应当适当推厚片。每一受检病例骨髓涂片均应推片810张，以
8、便存档和做组化染色。,分析前质量管理送检,涂片后应及时送检，因为多数细胞化学染色均需新鲜涂片。每张涂片中都应注明患者的姓名、取材日期、编号，血片用PB、骨髓片用BM表示。每份骨髓标本都应认真核对申请者姓名、性别、年龄、床号、住院号等，并做好骨髓编号，登记工作，以便查找和档案管理。,分析中质量管理形态学特征（标准）问题,目前应用的血细胞形态学标准有三种类型：其一为全国血液学工作者座谈会1960年4月颁布的统一血细胞名称的规定和该会委托沈阳医学院编（绘）著的临床血液学及细胞学图谱、导论和图谱说明，它对我国血细胞名称的规范化、统一化和细胞形态的标准化都起到了积极的作用。其二为从1980年起我国血液学
9、工作者对血液学新成果及FAB协作组白血病分类法不断地研究、讨论和修改，制定的血液病诊断及治疗标准，其中也包括血液学细胞形态学（诊断）标准。其三为中华人民共和国卫生部医政司编写和发行的全国临床检验操作规程中所载的骨髓象各阶段细胞的形态特征。,分析中质量管理染色,染色剂以Wright混合染色为佳。染液以覆盖血膜或骨髓膜为宜，染色时间长短与增生程度、膜厚度和室内温度有关，增生程度高、膜厚、室内温度低染色时间长、反之则染色时间短。染色效果，一般以加入第二液后低倍镜下观察到清晰分辨出中性分叶核后，流水冲洗干后镜检。根据临床经验，教科书中加第二液8-10分钟后冲洗不适宜血细胞形态检查染色。,分析中质量管理
10、分类,1）细胞分类和形态观察应在细胞不重叠、结构清晰可辩的涂片区域，达到这一要求往往是片尾和体尾交界处；强调巡视和观察两边界区域的重要性，是集异常细胞之处，故认真巡视此区域是发现问题的关键之处；2）灵活应用低倍镜调换油镜，熟悉油镜下的形态，可以说低倍镜是发现异常细胞的重要手段，油镜是辨别判定异常性质的工具；要注意细胞多与少之间的关系，避免顾此失彼现象，在鉴别诊断困难的疾病中，仔细观察和分析一些少见细胞常会引起柳岸花明的作用；注意细胞数量和质量的关系，两者既有独立性又有连贯性，在诊断上有的以数量为主，有的以质变为主；在光镜下，辨认某一个或某一类不典型细胞时，要理解单纯的形态学是有一定欠缺的，应多
11、观察视野和涂片，并参考其他资料，经反复识别和分析定之。,3）在光镜下骨髓细胞分类规定至少200个，必要时分类500个。细胞分类区域是以细胞充分展开的区域为准的，同时注意整个涂片背景，而不拘泥于一般所述厚薄均匀处。形态学检查的重点是发现问题，故对巡视涂片两边界区域的重要性也是质控的要求内容，就单个细胞而言，在识别某一原始细胞时，凭镜下的几个细胞就下结论为原粒细胞或原淋细胞。单纯的形态学或对照书本描述的形态来说是对的，可是把它拿到整体上去看，则未必是正确的。因此在阅片过程中或辨认细胞时还应注意涂片中的细胞和染色的背景，多观察几张涂片并寻找相关细胞之间的关系。密切结合临床和血象资料等，反复去认识和推
12、理或印证来决定或排除某一类细胞的性质。,分析中质量管理组化,血细胞化学染色是以形态学为基础，结合化学和生物化学技术，对血细胞各化学成分，代谢产物作定位、定性、半定量和定量观察的方法。血细胞化学染色也按统一标准执行。,分析中质量管理报告,血液涂片及时报告，一般不超过2h，常见病骨髓片8h内发出报告比较恰当，疑难骨髓片48h内发出，临床急于了解。病情可以口头或电话方式简单报告，但以正式报告为准。一般常见病骨髓报告有一名有经验检验者阅片后即可报告，疑难片最少需要2名有经验检验者共同阅片，甚至进行全科讨论或者患者所在科室临床医生进行沟通，结合临床骨髓形态学和其它相关检查，进行综合分析，加以诊断。,分析
13、后质量管理存档,血液涂片存档至少要保存48小时。骨髓细胞形态检查档案保存使用两种方法同时进行。传统方法：手工编号，填写相关资料，保存原始申请单和报告单。优点：骨髓涂片和组织化学染色保存完整，便于今后阅片和带教，总结资料。缺点：需要较大场地，查找不便。细胞图像技术：优点：报告图像直观，便于保存，查找方便，便于进行统计。缺点：采集图象在局限性，带教不便。,分析后质量管理反馈,反馈是指在工作结束或行为发生之后，通过对工作的回顾、总结和评价，发现工作中的偏差，并针对已经发生的偏差采取相应的纠正措施。血细胞形态学结果的反馈还必须加强与临床和患者的联系，报告与临床资料和治疗效果进行随访、观察，检验报告的准
14、确性。,参加室间控制的必要性,1）要积极参加区域性乃至全国性的血液常规室间质量评价活动，通过室间质评，实验室将自己的检验结果和其他实验室结果进行比对，找出差距，进行改进。卫生部临检中心已施行的骨髓涂片室间质评调查，有利于参加室间质评的各实验室对血液病知识的了解和检查技术的提高，室间质量评价是评估实验室质量的一项很有效的工作。,2）通过参加细胞形态学室间质量评价可以得到以下一些收获：经过质评工作，可以收集到各类型的病例资料齐全的骨髓涂片，特别一些少见的病种标本，给检测人员及进修生、实习生带来学习上的帮助，增加了知识面，开阔了视野；,3）通过室间质量评价，及时得到反馈的结果，可以重新进行镜下阅片，
15、达到学习提高的目的；4）开展细胞形态学质评工作，能提高检测人员对细胞形态的识别和诊断水平，结合细胞化学、免疫学、遗传学技术和临床病史体征，作出合理的诊断。这样补充了形态学的不足，全面综合分析作出诊断的室间质评，比单一的血涂片或骨髓涂片的形态质控更为合适。,血细胞形态学图像的建立,截止目前为止还没有研制出完全可靠的质控品来进行细胞形态学室间质量控制，血细胞形态学检验室间质量控制多采用质控标本彩色图片指定细胞识别的方式。血(骨髓)的取材、制片、染色、细胞着色，以及图片的放大倍数、显象的真实性、清晰度,细胞呈色、分色等均要符合标准。有利于参加室间质评的各实验室了解血液病知识和提高检查技术，促进形态学
16、检验质量的稳定和提高。但也存在一些问题，如从彩图上指认各种细胞，颇有“纸上谈兵”的味道，仅靠识别单个细胞容易存在片面性和不确定性，还会因概念不清、“细胞名称编码”不确切、答案不标准等直接影响到质评的结果。我省通过建立专家库，图谱选择标准，质评的管理制度促进提高。,计算机网络的建立,计算机网络就是使用各种网络设备和线路将电脑连接起来，通过网络可以快速的传递数据、文件，共享打印机等，细胞形态学组织室间质评单位和参评实验室建立网络就具有快速、准确、及时、省力、环保等优点。目前我省通过计算机网络及传统邮寄方式相结合方式进行血细胞形态学室间质量评价。登录临床检验中心的网站查阅图片并在线回报质评结果，也可
17、以接收临床检验中心打印的图谱，阅后将结果寄回中心，逐步达到所有科室通过计算机网络参加室间质量评价活动。,评分标准的建立,除了对单个细胞建立评分标准外，还应对细胞质量改变，细胞数量的变化，细胞化学染色结果，建立评分标准，全面提高检测人员对细胞形态的识别和诊断水平。,3、血细胞形态学检验存在的问题1）各医院血细胞检验设置不统一。多数医院由检验科临检室承担血液和骨髓细胞形态分类检验，部分三级医院检验科设有专门实验室，如止凝血实验室、骨髓细胞室。有的医院设有研究所，如血液研究所，隶属于血液科管理，一般不参加检验学会和检验中心组织的学术活动或质量控制活动，这给统一质量管理带来不便。,2）随着自动血液分析
18、仪的普及，出现了有过分依赖仪器检测结果，忽视血常规检验中的形态学观察，忽视用显微镜人工复检血细胞形态，从而造成漏检、漏诊及误诊等现象。3）检验人员专业知识面窄造成漏检。4）临床与实验室缺乏沟通与交流，临床医师缺乏实验室知识、技能和细胞形态学知识，诊断依赖实验室报告,实验室人员往往缺乏血液病基本知识与诊断及鉴别诊断的能力而“就形态论形态”，常出现报告不确实。,4、细胞形态学检查质量管理的现状1 ） WHO血液部分（英国）83个国家，每年6次，每次4张片；内容有血涂片、寄生虫、网织红交替发放。只反馈符合性。2）卫生部临床检验中心 600余家，每年3次；内容有：血涂片、寄生虫、尿有形成分。只反馈符合
19、性报告。,4）上海市临检中心(1).每年2次，发光盘资料，每张光盘有15个细胞涂片，内容有：血涂片、寄生虫、尿有形成分。只反馈符合性报告。(2).盲点质量调查、主要是血涂片，每年1次，内容为分类计数和异常形态分析。(3).举办细胞形态学质量管理学习班、培训专业人员、提高读片水平和判断能力。,综上所述，细胞形态学全面质量管理就是对细胞形态检查分析前、分析中、分析后各个环节进行全面质量控制与管理，减少分析误差，确保检查结果的准确性、可靠性、重复性和可比性，提高实验室和专业技术人员对细胞形态的识别和诊断水平，更好的为临床诊疗和患者服务。,二、尿沉渣检验质量控制与标准化,1、尿沉渣检验质量控制2、尿沉
20、渣检验标准化3、尿沉渣显微镜检查规范的介绍4、尿沉渣显微镜检查应引起注意的问题,二、尿沉渣检验质量控制与标准化,现代尿液分析除理学、化学检验外，最重要的是对尿中有形成分进行显微镜检查。但是对于理学检验结果正常、中性粒细胞酯酶、亚硝酸盐试带法结果正常的尿液，其显微镜检查的价值已被提出了质疑。如有学者提出，试带法结果若符合下列条件就可不做显微镜检查：白细胞阴性，红细胞阴性，蛋白质阴性，亚硝酸盐阴性。美国临床检验标准委员会（NCCLS）规定凡有下述情况的应进行显微镜检查：医生提出镜检要求的 。检验科规定的患者（如泌尿科、肾病科患者、糖尿病患者、应用免疫抑制剂患者及妊娠妇女），任何一项理学、化学检验结
21、果异常的，这一条和上述国内的观点不同，表明理学或干化学试带检查仅是一种普查试验，适用于正常人群的筛选，而疾病患者尿液一旦有颜色、透明度、气味或化学试验结果改变，均应进行显微镜检查。,1、尿沉渣检验质量控制,（1）检验前质量控制标本采集：一般留取50mL，以备标本的重复检验。宜采用新鲜晨尿中段尿液，尽量不加防腐剂，不能及时检查者应妥善保存和处理。女性病人应避免月经血、阴道分泌物混入，男性应避免前列腺液污染。检验报告单项目齐全。使用标准器材。标本处理：标本留取后应立即送检，尿标本收集后应在1h之内完成检验，否则选用合适的防腐剂并冷藏保存。采用可靠的尿沉渣质控物，以便能开展室内质量控制。及时将检查到
22、的正确结果反馈到临床。,1、尿沉渣检验质量控制,（2）检验中的质量控制：严格按操作步骤进行检验。用已知质控物监测仪器的分析。尿液细胞显微镜检验与化学分析仪检验结果对比。综合分析检验结果。,1、尿沉渣检验质量控制,（3）检验后质量控制：填报检验报告时应认真核对病人的各种资料与检验编号及结果是否相符。与临床沟通，分析检验报告的可靠性。做好各项记录。,2、尿沉渣检验标准化,（1）材料与仪器的标准化要求：标本容器：应干净、防漏，并由透明且不与尿液成分发生反应的惰性材料制成，容器及其密封装置不带干扰物质。收集容器体积大于50mL，具有直径大于4.0cm的圆形开口和较宽的底部。病人的姓名、编码、标本收集的
23、时间等标签应贴在容器上，不可贴在其盖上。标记：尿液分析的容器、试管、玻片必须能进行标记，便于病人的识别，材料应保持干净，不能附有微粒，减少尿液分析过程的干扰。离心管：干净、透明，便于尿液外观检查。体积刻度精确到0.1mL；其体积为1215mL，以防止在离心时尿液溢出。试管口密封装置，防止试管液体溅出，形成气溶胶。试管的底部为锥形或缩窄，便于浓缩沉渣。离心时机内温度应在1525。离心机相对离心力可稳定在400g，并定期对离心机的相对离心力进行校正。,2、尿沉渣检验标准化,（2）尿液标本的收集及运送：指导病人留标本，介绍留取标本的正确方法及有关注意事项。应告知病人采集标本的时间段，急诊病人可用随机
24、尿。标本保存时尽量不要使用防腐剂。在标本收集后2h之内无法进行尿液分析，且尿液中所要分析的成分不稳定，可加入特定的化学防腐剂。建立良好的标本接收制度。,2、尿沉渣检验标准化,（3）尿液分析：正确使用术语。干化学试剂带法测定尿比重受尿液酸碱度、中分子量化合物影响较大，只适用于正常人体检及初诊病人的筛检。应用尿比重判断肾功能时，应使用折射仪测定法。常规尿液的化学检查的内容包括：酮体、清蛋白、葡萄糖、白细胞酯酶、血红蛋白、亚硝酸盐、酸碱度、胆红素、尿胆原。,2、尿沉渣检验标准化,（4）操作规范：取尿液10mL离心（标本不足10mL报告时应注明），相对离心力（RCF）400g（水平式离心机，有效离心半
25、径15cm500r/min），离心5min。手持离心管4590弃除上层尿液，保留0.2mL尿沉渣。轻轻混匀后，吸取1520L注入到特制的计数区内，计数1L区域内的白细胞、红细胞、管型数；或取1滴（大约50L）置载玻片上，用18mm18mm或22mm22mm的盖玻片覆盖后镜检。防止产生气泡。低倍视野（1010）下观察尿沉渣分布的情况，再转高倍视野（1040）仔细观察细胞，细胞应观察10个高倍视野，管型应在低倍镜下观察20个视野，分别记录每个视野的细胞和管型数，计算平均值报告。定量计数板法以/L方式报告。,3、尿沉渣显微镜检查规范的介绍,1991年，美国NCCLS提出了“尿液常规分析”的推荐标准(
26、GP16-P),经过四年的实践，于1995年推出了“尿液分析和尿液标本采集、转运和保存”作了规定。日本临床检验标准委员会（JCCLS）在1995年提出了“尿液沉渣检查”的标准文件(GP1-P2)。1997年欧洲尿分析协作组也提出尿沉渣相关文件。80年代我国曾提出尿沉渣显微镜检查的规范，并在1995年的中华医学检验学会临床血液学检验与尿分析专题研讨会上进行了修订，同时建议逐步使用一次性专用的尿沉渣定量检测板，采用个细胞（或管型）/l的报告方式。中华人民共和国卫生部医政司又出版了全国临床检验操作规程第三版，对于尿沉渣检查作了具体的规定。由此可见，对于离心的尿量、盖玻片和载玻片大小、显微镜视野大小、
27、观察视野数、结果报告方式等，各国均作出了相应的规定。虽然各国的规定存在一定的差异，但主要目的有共同之处都是规范尿沉渣显微镜检查的操作，使结果更精确、更准确、更具有可比性、更符合患者和临床实际。,4、尿沉渣显微镜检查应引起注意的问题,（1）标本问题 尿沉渣镜检通常推荐采用晨尿，原因是晨尿最浓缩、能最大程度的反映有形成分的情况。近年来，有的学者提出采用晨间第二次尿液，即留取早上8点至9点钟尿液，避免因标本室温存放时间过长、细菌生长、蛋白分解、氨升高而使细胞、管型等有形成分破坏 。（2）染色问题 有的推荐采用活体染色，如Sternheimer-Malbin 染色（斯-马二氏染剂）、0.5%甲苯胺蓝染
28、色有助于细胞和管型的鉴别。对于尿中脂肪和结晶的鉴别，推荐采用偏振光显微镜，亦可用特殊染色，如脂肪、卵圆脂肪小体的油红O、苏丹染色，细菌的革兰氏染色，嗜酸性粒细胞的Hansel染色、Wright、Giemsa染色、巴氏染色，含铁血黄素颗粒的普鲁士蓝染色等。有的认为尿沉渣不必染色，因为有些染色会引起溶血，或因大量染液而稀释标本。,4、尿沉渣显微镜检查应引起注意的问题,（3）使用标准化尿沉渣检查器材的问题 目前，推荐采用商品化沉渣检查器材的呼声越来越高，原因是这些装置具有检查尿量、离心力、离心时间、留取沉渣量、检查量、报告单位等统一的特性。可保证检查结果的精密度、准确度良好。如近年研制的Diasys
29、 R/S2003系列尿沉渣分析板，采用了高质量的光学玻璃制成计数室，可以保证每个标本在同样体积、同样厚薄的区域内进行分析，能在普通光学显微镜或相差显微镜下观察，并具有自动混匀、自动吸引、自动清洗、自动稀释等功能。 （4）显微镜检查和结果报告问题 有的推荐显微镜检查应在较弱光线下进行，这样比较容易观察管型（如透明管型）和异形红细胞，当发现可疑成分时要由高级检验员复核。所有的显微镜检验结果必须和理学、化学检验结果符合，反之亦然。若存在不一致的结果，应在最终报告之前解决这类问题。,4、尿沉渣显微镜检查应引起注意的问题,（5）室内质量控制问题 尿沉渣中有形成分质量控制是一个难点。目前，国外已有厂商生产
30、了用于尿沉渣和化学试带检查的质控物，但价格昂贵，所以应加紧适合国情质控的研制。尿沉渣室内质控方法尚待建立。欧州的方法是，除每日用质控物观察有形成分外，还定期开展沉渣的形态学培训班，并由有经验技术人员组织定期考核，国内开展这方面工作的单位相对较少。,小 结,尿液显微镜检查的质量控制是一个难点，目前缺乏标准化与规范化的程序，而显微镜检查又是尿液有形成分检查的“金标准”，所以需要探讨合理的流程与方法。以上所述只是尿液显微镜检查质量控制流程中分析中的因素，一个完整的质量控制流程包括分析前、分析中与分析后的质量控制，尤其是分析前因素中留取合格尿标本是质量控制的一个关键因素现在大多数医院都采用自动化的检测
31、设备加上显微镜的复检，最后得出一份完整的尿液分析检验报告，所以质量控制流程也包括自动化检测设备的质量控制，应该统筹考虑，建立适合本实验室实际情况的质量控制流程。总之，尿沉渣显微镜检查至今仍是一项非常有价值的临床试验，其检查操作的规范化将有利于临床疾病诊断和疗效观察，应使临床医师充分认识和配合，更应引起检查人员高度重视和认真执行。,三、细菌形态学检查的质量控制,1、菌落形态学(colonial morphology)2、细胞形态学(microscopic morphology)3、结核病细菌形态学检查的质量控制4、如何提高痰菌检查的质量？5、废弃物处理6、存在问题,概 述,形态学检查在临床微生物
32、学检验工作中更重要体现在标本直接制片、染色和显微镜下观察，对于感染性疾病病原体的诊断有重要的意义 。如痰标本涂片中的白细胞数和鳞状上皮细胞数决定了这个标本是否做培养。同时，菌体形态及是否在白细胞内等信息为痰标本培养出的微生物是否为致病菌提供了重要线索。各种标本的抗酸染色是分枝杆菌感染诊断的重要经典方法；肠道菌群紊乱腹泻革兰染色结果可以提示是酵母菌或者是葡萄球菌引起的，水样粪便标本暗视野观察穿梭运动，如果抑动试验阳性，对于霍乱快速诊断有很重要价值；脑脊液标本墨汁涂片见有厚荚膜圆形酵母样菌体，给新型隐球菌脑膜炎提供了快速的诊断方法。阴道分泌物涂片，革兰染色对于阴道炎和细菌性阴道病的诊断及其重要，现
33、已有标准方法通过革兰染色涂片诊断细菌性阴道病 。以上这些例子说明标本的形态学检查为感染性疾病诊断有着十分重要的意义。,概 述,然而在我国细菌形态学检查方面还很落后，主要原因是专业教材中描述细菌形态学的内容较少，有些内容甚至是错误的，缺少模式菌株形态学图谱作参照。实验室所用的形态学检验方法有些陈旧，使用的培养基、试剂有些不规范。我国缺少关于细菌形态学检查的标准方法，这些原因导致我国临床微生物学没有很好的基础，使我国临床微生物学发展滞后。细菌形态学正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形态。因此，提出建立细菌形态学检查方法标准化非常必要。细菌形态学包含菌
34、落形态学和细胞形态学两大类。,1、菌落形态学(colonial morphology),细菌在合适的培养基表面生长形成菌落。利用菌落的形态学可以鉴定一些菌种。菌落的形态学包括菌落大小、形状、高度、边缘、颜色、表面状态、密度、硬度。菌落形态学一般在培养2448 h内肉眼观测，不同培养基菌落形态学可发生变化。尽管国内有些文献曾描述过菌落形态学的内容，但不尽完善，如大菌落、小菌落如何区分？菌落高起和凸起如何区别？边缘波浪状和卷曲状怎样鉴别？诸如此类问题没有标准答案.,1、菌落形态学(colonial morphology),菌落形态学对于菌种的鉴定有重要价值。例如：(1)鉴定具有临床意义的葡萄球菌根
35、据菌落大小、色素和溶血性进行初步鉴定。(2)菌落形态值得关注的一个重要现象就是爬动(swami)，变形杆菌菌落形态特征就是典型的“爬动”。对人有致病性的弧菌有副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌(Vharveyi)，这3种弧菌的菌落形态可以表现为爬动。菌落的爬动主要是由于其鞭毛的特殊运动，尤其是侧鞭毛更能体现菌落的爬动功能。,2、细胞形态学(microscopic morphology),细胞形态学主要是指用显微镜观察细菌细胞大小、形态、细胞排列方式、细胞的特殊结构等描述细菌细胞形态的学科。显微镜形态学所用的方法是鉴定细菌基本方法，对于鉴定起着导引鉴定方向的作用。,2、细胞形态学(microscop
36、ic morphology),（1）细菌图片：将被检物如脓、痰、脑脊髓液、分泌物、尿或培养基上菌落直接涂于玻璃片上，按程序染色后，在光学显微镜下查找细菌。该检查一般不做确诊用，故报告结果时只能说明细菌形态特点(如革兰氏阳性双球菌)，而不能报告细菌名称(如肺炎双球菌)。但因其操作简单、快速、省时，可以很快得到结果，所以在某些情况下可用以急查标本中有无致病菌，以作为早期诊断及治疗的参考。,2、细胞形态学(microscopic morphology),（2）革兰氏染色法(以龙胆紫及复红为主要染料)的操作步骤 1）取新培养的大肠杆菌(或变形杆菌)和表皮葡萄球菌分别制成细菌悬液。 2）取洁净玻片数张，
37、平放桌上，取一白金耳的大肠杆菌菌液放置于各玻片的左端，涂成直径1一1.scm的圆形细菌涂片，自干。 3）再用一白金耳表皮葡萄球菌菌液放置于大肠杆菌涂片的中央，使成0.5cm左右的菌液区，自干后在火焰上通过数次固定，存放玻片盒中备用。 在实际工作中，取涂片一张，在大肠杆菌和表皮葡萄球菌双重涂片的右侧放上一滴或二滴(两处)生理盐水，取一种或两种被检菌分别制成薄的徐片，自干，固定后与左侧质控菌双重涂片同时作革兰氏染色。 最后结果观察.,3、结核病细菌形态学检查的质量控制,结核病细菌学检查作为结核病诊断治疗的黄金标准正日益受到各级结防部门的重视，痰涂片镜检是当前结核病控制工作中最重要的实验室手段，是发
38、现传染源的最主要途径，也是确定结核病诊断、化疗方案的重要依据和考核疗效、评价防治效果的可靠标准。痰涂片镜检作为结核病细菌学常规检查方法与我国各级结核病实验室设备配置、技术水平相适应，符合我国和发展中国家现有的经济条件和国情。痰涂片检查并不复杂也不高深，提高其检测水平的关键在于实施强有力的痰检质量控制，质量控制是痰涂片检查这一技术手段在结核病控制规划中有效发挥作用的有力保证。,3.1结核病细菌形态学检查分析前的质量保证,3.1 标本的采集、运送和保存3.1.1 痰标本的采集：留取清晨从肺深部咯出的痰标本35 ml，合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样，痰盒直径4 cm、高2 cm，为有盖密闭
39、的塑料盒或蜡纸盒,容器应注明患者姓名、编号(门诊卡号或病案号)及送检日期。3.1.2 痰标本的运送和保存：留取标本后，切勿倒置，严防痰液外溢,放入指定地方，由专职收集标本者认真核对痰盒上姓名、序号及检查项目，按顺序排好密闭条件下送至实验室，并做好收集标本的登记工作，以便及时查对，当天不能检查的痰标本应置4度冰箱保存。,3.1结核病细菌形态学检查分析前的质量保证,3.1.3 玻片的准备：取经95%酒精擦拭脱脂的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片，于背面左端1/3处用玻璃笔编号。每张玻片限用1次，不得重复再次用于抗酸染色检查。3.1.2 涂片制作：可分为直接涂片法(厚涂法、薄涂法)和集菌涂片法(漂
40、浮集菌法、离心沉淀法)。建议采用抗酸染色使用直接涂片厚涂法。方法为用竹签或接种环挑取痰液中干酪样或脓样部分0.1050.11 mL，于玻片正面2/3中央均匀涂抹成2 cm-2.15 cm椭圆型痰膜，自然干燥后微火固定备染色。荧光染色使用直接涂片薄涂法，方法为用竹签或接种环挑取痰液中干酪样或脓样部分0.1 mL，于玻片正面2/3中央均匀涂抹成1 cm-2 cm椭圆型痰膜，自然干燥后微火固定备染色。,3.2质量控制,3.2.1 标准 卫生部结核病控制中心和中国防痨协会，在1996年下发了国家结核病控制规划痰标本结核菌检验质量控制方案，并在全国实施，使我国痰涂片检验质量控制有了统一标准和技术规范。3
41、.2.2 质控方法 国家结核病控制规划痰标本结核菌检验质量控制方案是我国痰检质控的标准。主要模式是上级实验室逐级定期对所辖的下级实验室进行督导，抽取痰片复验，考核评价涂片制作与镜检水平。WTO推荐的双盲法，要求所有保存痰片的标签上只填实验序号，不填结果，地市所抽复验痰片的结果由省参比实验室对照县细菌学实验室原结果作出判定，当两地结果不一致时以省参比实验室复核结果为准。这样能客观地反映和评价痰涂片检验质量，避免在质控工作中弄虚作假、敷衍了事。,3.2质量控制,3.2.3 质控内容 (1)室内质控包括：痰标本的收集、染色液的制备、涂片制备、染色、显微镜维护、镜检、结果登记以及痰片的保存。方式采用自
42、查和互查。(2)室验后质控包括：实验室布局流程、实验室安全防护和污染物的处理、抽取痰片复验、实验室日常工作记录。3.2.4 质控要求 阳性片符合率98%；阴性片符合率96%；制片质量(痰细胞、面积、厚薄、脱落)合格率90%；染色合格率95%；不允许1十以上的阳性片出现假阴性；标本合格率应达到90%。,4、如何提高痰菌检查的质量 ？,4.1.1 实验室及设备 各级结防机构应有独立的结核病实验室，实验设备完好，有安全防护、消毒、灭菌设施。4.1.2 痰检人员与培训 市、县级结核病实验室必须有专职的痰检技术人员。技术培训是痰检质控的重要内容之一，省参比实验室、市细菌学实验室承担对下一级痰检人员的培训
43、任务，痰检人员必须经过省、市级培训以后才能上岗。保持人员的稳定性是保证痰检质量的前提。,4、如何提高痰菌检查的质量？,4.1.3 痰检工作程序 痰检人员按照/结核病诊断细菌学检验规程的要求，从标本的收集、涂片、染色、镜检、记录本的填写、痰片的保存、显微镜使用维护、个人防护、废弃物的处理等都应按技术规范的要求做。主要注意以下几点痰检工作的质量。(1)获得合格的痰标本：对确实无痰或少痰的病人，门诊医生可采用超声雾化取痰。(2)制片：涂片大小应为2-2.15cm的卵圆形，厚薄适当、涂抹均匀。(3)染液配制及染色：染液的浓度应准确，染色后痰膜脱落面积不超过10%。,4、如何提高痰菌检查的质量？,(4)
44、造成染色性不好(菌不红)的原因有以下几点：染色时未加热或加热不充分；石炭酸复红浓度不够，染色时间太短。(5)镜检：油镜连续观察300个视野没有找到抗酸菌，才能报告镜下未找到抗酸杆菌。(6)痰片保存：应保存近期三个月量的所有涂片，弃旧存新；每个初诊病人的3张涂片和每个随访病人的2张涂片应保存在玻片盒的相邻位置。(7)增加现场督导次数：提高痰检质控的频率和覆盖率，督导时观察从标本收集、登记、涂片、染色、镜检的全过程。,4、如何提高痰菌检查的质量？,(8)个人安全防护与废弃物的处理：实验室应有合理布局及合适的单向通风体系，实验人员要有安全防护意识。痰标本使用完后连同废弃物一起高压灭菌后才允许丢弃。痰
45、涂片检查与质量控制工作是为结核病控制规划服务的，工作的好坏直接影响到结核病控制项目的顺利进展，因此规范痰结核病细菌学检验，加强痰涂片质量控制是一项长期、制度化的工作，必须持之以恒地坚持下去，在工作中不断总结经验，有效地巩固和提高痰检质量。痰涂片染色镜检是结核病确诊和治疗的主要依据，在结核病控制工作中占有不可缺少的位置。因此每个实验室应建立结核菌涂片的室内、室间质控体系，提高各级实验室的细菌学服务质量，提高结核病的发现率，为国家结核病控制规划的实施提供强有力的保证。,4、如何提高痰菌检查的质量？,4.1.4染色、镜检、报告标准：根据实验室对某一种方法的熟练程度，选择不同的抗酸染色法。荧光染色法在
46、暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光,染色后涂片均应完整，无黄色斑块。报告标准见技术规范。4.1.5 复查标准：阴性涂片应复查10%20%，阳性涂片应复查50%以上(新发现患者涂片应全部复查)。阴性涂片在复查100个视野如发现可疑阳性不得超过5%，发现阳性(+)不得超过2%，中等阳性(+)不应被发现。阳性涂片阳性(+)以上，复查300个视野未发现抗酸杆菌为不符合。,4、如何提高痰菌检查的质量？,4.1.6 痰涂片假阳性、阴性原因分析：1）造成假阳性原因可能为:弄错标本、编号错误、标签贴错、记录错误；涂片存在红色杂质颗粒，技术员经验不足；玻片上有划痕；操作失误阳性标本溅到阴性标本上；镜检时香柏
47、油滴管接触到阳性标本或油镜碰到涂片上等污染所致。2）造成假阴性原因可能为：标本留取不合格；高温存放时间过长，使标本失去抗酸性；挑选标本不当或涂片厚薄不均匀；染色未加温或加温过热至沸腾；技术员经验不足或操作不认真等原因所致。,5、废弃物处理,痰盒须经高压蒸汽灭菌或彻底焚烧后处理，痰玻片须经0.12%0.15%过氧乙酸或有效氯含量5001000 mg/L消毒液浸泡3060 min，再行高压灭菌处理,操作台面以3%石炭酸或其他消毒液擦拭后，紫外线灭菌灯(距离1.12m)照射30 min。以上痰检全过程除染色、镜检外全部在二级生物安全柜内操作。,6、 存在问题,有些地方对实验室工作和痰检人员重视不够，限制了实验室工作的开展和痰检人员的积极性；由于痰涂片传染性大，造成基层实验室人员不稳定；实验室材料缺乏标准化，技术缺乏标准化，造成服务质量的下降；各级培训和督导力度不够，基层工作人员很少接受规范培训和质控；多数基层实验室条件简陋，缺乏必要的实验用品。,7、对 策,加强各级领导对实验室工作的重视和质控体系的认识；保证基层实验室必要的工作条件，确保实验质量；加强各级培训和督导，使实验室技术标准化、统一化；加强院内感染控制，争强工作人员防范意识，做好防护与消毒灭菌工作；严格每)个过程(标本留、送、涂、染、检)，保证痰检的质量、完善质控体系,提高实验室服务质量。,谢谢,
