1、p38MAPK信号通路在草酸钙肾结石形成中的作用研究,湖北省中医院泌尿外科曾令启,p38MAPK信号通路概述,丝裂原激活蛋白激酶（ MAPK，mitogen-activated protein kinase）是哺乳动物广泛表达的苏氨酸/络氨酸激酶，具有双重磷酸化能力ERK，JNK，P38MAPK主要功能：传递信号（细胞外 细胞内）应激刺激（UV、H2O2、热休克、缺氧等）、炎性因子（TNF-、IL-1、IL-18 、FGF等 ）、LPS、G细胞壁成分 p38激活 诱导保护蛋白质合成 细胞周期（生长、凋亡、分化）,四种亚型：、p38MAPK、：几乎在所有的组织中均有表达，调节细胞基本的生命活动，
2、并且在应激反应中起主要作用p38MAPK：肺、胰腺、肾脏、睾丸和表皮组织p38MAPK：骨骼肌、心脏和胸腺中含量丰富，控细胞的糖代谢。,p38MAPK通路阻断：吡咯咪唑类化合物， SB206718、SB220025、SB202190、SB203580、 B239063、VKl99等 p38MAPK与疾病： 炎症（类风湿性关节炎、哮喘、）；心血管疾病（心肌细胞功能障碍，缺血再灌注损）；肿瘤；神经退行性疾病（ Alzheimers disease、Huntingtons disease、 ParkinsonS disease、multiple sclerosis、 amyotrophic late
3、ral sclerosis ）；糖尿病；眼部疾病；急性肺水肿；疼痛（前列腺炎等）。,经Ras蛋白活化丝裂原蛋白激酶,应激因子 细胞G0转入G1期 活化受体TPK 调节mRNA转录和翻译 RasGDP RasGTP(有活性) 活化Raf(具MAPKKK活性) 催化c-jun,c-fos,c-myc磷酸化 MAPKK磷酸化 MAPK磷酸化,COM结晶与肾小管上皮细胞相互作用,细胞损伤：产生ROS、诱发脂质过氧化及炎症因子（IL-6、MPC-1）晶体粘附和滞留：通过大分子物质之间的识别迅速而牢固地粘附于上皮细胞膜发生滞留启动结石形成的级联反应细胞摄入晶体：肾小管上皮细胞主动摄入晶体细胞内事件：一些细
4、胞死亡，一些细胞基因激活而增殖，或促进细胞产生大分子物质来调节结石的形成细胞间质钙化：加剧细胞毒性，诱发炎症和坏死,COM结晶激活p38MAPK信号通路的研究,目的：探索草酸钙肾结石形成过程中p38MAPK的作用,实验方法,人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）细胞在各个时间点（030min）暴露于一水草酸（COM）结晶（20g/cm2 ）暴露于DMEM作为阴性对照，暴露于茴香霉素（10g/ml）30min作为阳性对照Western Blot检测磷酸化p38MAPK和总p38MAPK（磷酸化/去磷酸化）的活性观察通过使用肝素特异性地抑制COM结晶与HK-2细胞的结合而阻滞p38MAPK的激活观察通过
5、使用SB203580对p38MAPK特异性的抑制而消除COM结晶诱导的DNA合成,结 果,一、COM结晶诱导p38MAPK的活性：1.细胞暴露于COM结晶逐渐诱导磷酸化p38MAPK的免疫活性，p38MAPK的最大激活发生在COM结晶暴露15min，磷酸化p38 MAPK的免疫活性平均增加为超过对照组的4.6倍,时间(min) 0 5 15 30 30COM - + + + -茴香霉素 - - - - +图1. COM结晶和茴香霉素在不同时间诱导磷酸化p38 MAPK的免疫活性,时间(min) 0 5 15 30 30COM - + + + -茴香霉素 - - - - +图2.密度计定量分析磷
6、酸化p38 MAPK的免疫活性水平 注：p0.001（草酸组 vs 对照组，15min） p0.01（茴香霉素组 vs 对照组30min）,2.用抗总p38MAPK的抗体进行Western Blot，COM结晶的暴露并不能改变p38 MAPK蛋白质的总量。 时间(min) 0 5 15 30 30 COM - + + + - 茴香霉素 - - - - +图3.Western Blot显示p38 MAPK蛋白质总量,二、COM结晶诱导p38MAPK的激活作用需要COM结晶与肾 上皮细胞的结合： 1.肝素（50、100g/ml）暴露于HK-2细胞抑制COM结晶与HK-2细胞 结合 COM + +
7、+ 肝素(g/ml) - 50 100图4.肝素对COM结晶与HK-2细胞结合的抑制作用,2.肝素抑制COM结晶刺激的p38MAPK的磷酸化作用和p38MAPK的活性（图5，图6）, 但是肝素（50、100g/ml）对COM结晶与HK-2细胞结合的抑制作用对总p38 MAPK的蛋白质总量没有影响（图7）。 COM - + + + 肝素(g/ml) - - 50 100 图5. Western Blot显示肝素抑制COM结晶诱导的p38MAPK的磷酸化作用,COM - + + + 肝素(g/ml) - - 50 100图6. Western Blot显示肝素抑制COM 结晶诱导的总p38MAPK
8、的活性,COM - + + + 肝素(g/ml) - - 50 100图7. Western Blot显示肝素对总p38MAPK的蛋白质总量没有影响,三、COM结晶诱导的DNA合成1. HK-2细胞暴露于COM结晶导致DNA合成的再启动。COM结晶诱导DNA合成在一定的范围内（2100g/cm2、10500g/ml）是一种剂量依赖性的关系如图8。在20g/cm2 -100g/ml的COM结晶暴露观察到明显的刺激刺激作用，超过对照组2倍多（p0.01） COM结晶 0 2 4 10 20 40 80 100图8. COM结晶诱导的DNA合成作用，超过对照组2倍多（p0.01）,四、SB20358
9、0抑制COM结晶诱导的DNA合成： 在SB203580缺乏或者其浓度逐渐增加的条件下，HK-2细胞在各时间点（024h）暴露于COM结晶（20g/cm2）。暴露于COM结晶导致DNA合成超过对照组2倍。用SB203580以一种剂量依赖性方式抑制COM结晶诱导的DNA合成，在20mol/L时完全抑制。 SB203580(mol/L)0 0 1 5 10 20 30 50 100 COM （20g/cm2 )- + + + + + + + +图10. SB203580抑制COM结晶诱导的DNA合成,结 论,COM结晶与肾小管上皮细胞相互作用快速而强烈的激活p38 MAPK信号通路并诱导DNA再合成，同时可被特异性抑制剂抑制COM结晶与肾小管上皮细胞结合是结石形成的重要环节，也可被特异性的抑制剂抑制p38 MAPK信号通路通过调节COM结晶对肾上皮细胞的作用而在肾结石形成过程中起重要作用为我们进一步探索草酸钙肾结石的发病机理提供理论基础，也为草酸钙肾结石的治疗提供了一个新的特异性靶标。,欢迎各位专家批评指正！ 谢谢！,
