1、降血糖药物筛选方法,2010年11月5日,导论动物水平筛选细胞水平筛选酶和受体水平筛选总结和思考,糖尿病（DM, Diabetes Mellitus）,糖尿病为一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。指标：餐后2 h 血糖高于11.1 mmol/ L空腹血糖高于7.0 mmol/ L,发病率,全球糖尿病患者人数已超过1.77亿，预计到2025年将达到3.7亿，成为继心血管和肿瘤之后第三位“健康杀手” （WHO）。中国糖尿病发病率达5%，全国糖尿病患者人数已在3000万以上，糖尿病患者的人数仅次于印度居世界第二位。,世界糖尿病日,纪念
2、胰岛素的发现者班廷的诞辰，世界卫生组织（WHO）和国际糖尿病联盟（IDF）将班廷医生的生日11月14日定为世界糖尿病日（WDD）。,班廷，Banting，加拿大生理学家（1891-1941）,控制糖尿病，刻不容缓！（Letstakecontrolofdiabetes.Now！）,糖尿病的事实,全球每30秒就有一人因糖尿病而截肢。 每年死于糖尿病的人远远高于死于艾滋病的人。2005年，全球约290万人死于糖尿病。 每年患糖尿病的人数增加700万，而且多数集中在亚洲。 每10秒中，就有人死于糖尿病相关性疾病；同时，就有2例新病例被诊断 在发达国家，糖尿病是成年人失明和视力障碍的主要原因。 2型糖尿
3、病占糖尿病患者的90以上。 肥胖是2型糖尿病的主要危险因素。,并发症,糖尿病可导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭、神经病变、肢体坏疽以致截肢、昏迷等多种并发症。,治疗药物,磺脲类： 格列本脲（优降糖）格列齐特（达美康） 格列吡嗪（美吡达）格列喹酮（糖适平 格列美脲（亚莫利）双胍类： 苯乙双胍（降糖灵）二甲双胍（美迪康） 糖苷酶抑制剂： 阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣） 胰岛素增敏剂：罗格列酮（文迪雅） 胰岛素：诺和灵、优泌林,二、动物水平筛选,2.1 I型糖尿病动物模型 造模方法： 采用化学试剂破坏胰岛细胞造模或因为遗传因素，胰岛细胞受到自身免疫性破坏而产生的。 1）化学试剂诱导的高血糖动
4、物模型 链脲霉素（四氧嘧啶）诱导的高血糖动物模型,链脲霉素诱导的高血压动物模型,原理： 含亚硝基的化合物 特异性破坏胰岛细胞 诱导NO大量合成 激活自身免疫过程 STZ量决定细胞损伤程度： 凋亡（低剂量） 高剂量（坏死）,链脲霉素结构,方法：一次性大剂量静脉或腹腔注射STZ 大鼠（60-80 mg/kg） 小鼠（100-200 mg/kg）注意： STZ水溶液不稳定，生物半衰期5 min，造 模时新鲜配置、快速注射。结果：注射72 小时后，血糖稳定升高，动物出现 三多症状（多食、多饮、多尿）。 优缺点：造模快速、模型稳定、组织毒性小；但 价格昂贵,2）自发性糖尿病大鼠（BB大鼠）,渥太华Bio
5、breeding实验室培育出来的自发遗传I 型糖尿病大鼠。发病机制：自身免疫性破坏胰腺细胞引发胰腺炎发病特征：于出生后60日发病，体重减轻，糖尿， 低胰岛素，胰腺炎、胰岛细胞减少， 须胰岛素治疗才能生存。,2.2 II型糖尿病动物模型,II 型糖尿病动物模型的病理生理改变 胰岛素抵抗增加 基础肝糖输出率增加，空腹高血糖 胰岛细胞功能减退 胰岛素抵抗的出现，为维持血糖稳定，胰岛细胞分泌胰岛素代偿性增加，最终导致细胞分泌功能障碍，发展为糖尿病。,1）高糖高脂饮食诱发II型糖尿病动物模型,方法： 采用占热量61%高脂饮食（饱和脂肪酸的动物脂肪，蛋白质19%，碳水化合物20%，脂肪61%），饲养3-6
6、周。指标： 血糖升高，胰岛素水平升高，出现明显的胰岛素抵抗。优缺点： 模拟人类高糖高脂膳食诱发糖尿病模型； 但造模时间较长，成本高，不稳定。,2）自发性糖尿病大鼠（PO大鼠）,PO大鼠又称嗜沙肥鼠发病特征： 出生两周后，90%PO大鼠出现明显的胰岛素抵抗症状。发病阶段： 起始阶段，血清及胰岛素水平正常 胰岛素水平升高，血糖正常 高胰岛素水平，高血糖水平 胰岛细胞受损，导致低胰岛素和高血糖,3）肥胖高血糖小鼠（ob/ob小鼠）,发病特征：体型极胖，早期有高血糖和糖尿，血清胰岛素水平高，有明显的胰岛素抗性。胰岛肥大增生，胰岛素含量增加。用途：胰岛素增敏剂的研究,4）糖尿病小鼠（db/db小鼠）,发
7、病特征：体型极胖，脂肪沉淀，早期有高血糖和糖尿，高胰岛素血症，晚期可见胰岛细胞坏死。,2.3 降糖药物体内药效评价方法,利用糖尿病动物模型评价药效，主要以空腹血糖、糖耐量及胰岛素敏感性为指标。a）空腹血糖测定 取材：动物禁食过夜，次日眼眶采血，测 定血糖浓度。 方法：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法以及 血糖仪。,葡萄糖氧化酶法（国内推荐方法）,葡萄糖,+ O2,葡萄糖氧化酶,葡萄糖酸,+ H2O2,H2O2,+ 4-氨基安替吡啉,+ 酚,过氧化物酶,醌亚胺,+ H2O,醌亚胺在480-550 nm有最大吸收峰，醌亚胺与葡萄糖的量成正比，比色法测定醌亚胺的量，即可得到葡萄糖浓度。,原理：,方法：,葡
8、萄糖氧化酶过氧化物酶磷酸缓冲液酚4-氨基安替吡啉,孵育15 min,505 nm测定吸光度OD,结果：局限：还原性物质如尿酸、维C、胆红素等，可 与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反 应过程中所产生的过氧化氢，使测定结果偏低 举例：,葡萄糖浓度 =,A样品-A空白,A标准-A空白,X 标准浓度（mM）,血糖仪,方法： 手指采集1 ul血样，将试纸顶端轻靠血样，试纸就可以自动吸收血样，插入血糖仪，只需5秒快速显示测试结果特点： 方便、快速、简单，主要用于糖 尿病患者日常监控血糖，但准确 度稍差。,b）糖耐量试验,口服糖耐量试验： 糖尿病诊断主要指标，也是降糖药物药效评价的主要指标。原理：口服葡萄
9、糖后，血糖迅速上升，刺激胰岛素分泌，肝糖元合成增加，血糖持续下降。正常人服用葡萄糖30-60 min，血糖达到最高峰，之后迅速下降，在2 h左右，血糖降至正常。糖尿病时，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超过正常，且2 h不能下降到正常 。,方法： 实验前动物过夜禁食，灌胃给葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），或淀粉（3-5g/kg）。测定给糖后0 h，0.5 h，1 h，2 h血浆血糖浓度，并绘制血糖变化曲线。结果：,哪一个样本是糖尿病鼠？哪个是降糖药治疗后样本？,c) 胰岛素释放试验,目的：检查胰岛功能和胰岛素分泌水平原理：I型糖尿病，空腹胰岛素水平很低； II型糖尿病，空腹胰岛素水平正常或偏高，
10、葡萄糖刺激后，胰岛素分泌增加； 部分药物可促进胰岛素分泌，提高胰岛素水平方法：灌胃给葡萄糖或蔗糖（2.5 g/kg），或淀粉 （3-5 g/kg）.测定给糖后0 h，0.5 h，1 h，2h 血浆胰岛素浓度，并绘制胰岛素变化曲线。,胰岛素测定方法（ELISA）：原理：预先包被胰岛素抗体在ELISA 板上，加入样品后，样品 中的胰岛素与包被抗体结合，再加入生物素标记的抗胰 岛素单克隆抗体，结合已俘获胰岛素的另一端，最后加 入过氧化酶标记的抗生物素，生物素与抗生物素结合。 通过过氧化物酶底物显色来定量测定样品中的胰岛素。,方法：胰岛素测定试剂盒（wako）组成：抗胰岛素包被板；胰岛素标准溶液；生物
11、素标记的抗胰岛素抗体；HRP 标记的链酶亲和素；显色底物；终止液；洗涤液 试验操作：参见试剂盒说明 结果：,胰岛素标准曲线,图 哪个样品为正常，I型或 II型病人？图 哪个为治疗前或治疗后？图 哪个为治疗前或治疗后？,图,图,图,d) 葡糖钳技术(glucose clamp technique),葡糖钳技术是美国耶鲁大学医学院于1979年创立的一种临床测定胰岛素分泌或胰岛素敏感性的定量技术。 正糖钳：对胰岛素的敏感性的定量分析，是国际上公认的评估胰岛素敏感性和细胞功能的“金标准” 。正糖钳技术原理： 静脉注射胰岛素使其维持高水平； 同时静脉注射葡萄糖使血糖维持在基础血糖水平上。高胰岛素水平代谢
12、葡萄糖，为维持血糖需不断注射葡萄糖，当葡萄糖注射速率平衡时，此时的速率相当于体内代谢葡萄糖的速率。1983发展大鼠正糖钳试验。,Dr. Jim Liebau,方法：大鼠麻醉颈静脉插管接三通管，两个进口端一侧输入10%葡萄糖，一侧输入胰岛素，出口端接静脉插管手术完毕，输入4 mU/kg/min胰岛素，同时输入10%葡萄糖 每隔10 min测定血糖血糖输入速率至稳态后，记录连续60 min葡萄糖输注速率 稳态下6次葡萄糖输注速率平均值为GIR， 6次血糖平均值为BG,结果：,稳态葡萄糖注射速率GIR值 11.56 mg/kg/min 血糖平均值BG 值4.13 mM,哪个样品胰岛素敏感度高？哪个样
13、品是来自药物治疗后大鼠？,三、细胞水平降糖药物筛选,脂肪细胞（肝细胞）-葡萄糖消耗 葡萄糖转运试验,1. 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗实验,脂肪细胞,11mM葡萄糖含药培养液,培养24或48 h,检测培养液中葡萄糖消耗量,葡萄糖氧化酶法,计算葡萄糖消耗量,阳性药物可选择二甲双胍,糖消耗量(mM)=11mM-培养基葡萄糖浓度(mM),2. 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运实验,脂肪细胞,加药培养24h,0.5 uCi/ml2-deoxy-H -D-glucose,3,孵育10min,加NaOH裂解细胞,细胞裂解液,KRP缓冲液清洗3次,H 含量,同位素测定仪,KRP缓冲液组成：131.2 mM
14、NaCl，4.7 mMKCl，2.47 mM CaCl2， 1.24 mM MgSO4, 2.48 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES,3,b-细胞损伤模型H2O2链脲霉素四氧嘧啶 b-细胞胰岛素分泌模型 b-细胞ATP敏感钾通道阻断剂,四、分子水平降糖药物筛选,4.1 a-糖苷酶抑制剂筛选原理： 饮食中淀粉和蔗糖(双糖)不能直接被肠壁细胞吸收，需要在小肠绒毛上的多种-葡糖苷酶的作用下生成单糖(葡萄糖及果糖)后才能被吸收。 -糖苷酶上具有与寡糖及双糖相结合的位点，药物与这个位点结合，能可逆性地抑制小肠绒毛上的多种-葡糖苷酶的活性。,-糖苷酶有多种，包括：蔗糖酶；葡萄糖淀粉酶；麦芽糖
15、酶；糊精酶。,阿卡波糖,阿卡波糖与-蔗糖酶结合位点,方法：,p-NPG(底物)磷酸缓冲液0.2U/ml a-糖苷酶一定浓度药物,保温 30 min,Na2CO3终止反应,405 nm测定释放p-NP量,p-NPG为对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷（无色）p-NP为对硝基苯酚（黄色）,4.2 蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B (PTP-1B)抑制剂筛选,原理： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)是胰岛素信号转导通路的负调节因子，与II型糖尿病密切相关。 PTP-1B过度表达将会使胰岛素受体去磷酸化，无法与胰岛素结合，引起胰岛素抵抗。,方法：结果：,p-NPP液PTP-1B酶液一定浓度药物,37 度孵育0
16、min,405 nm处测定吸光度OD值,PTP-1B活性=,（给药组OD10min-给药组OD0min),（对照组OD10min-对照组OD0min),x100%,37 度孵育10 min,p-NPP为对硝基苯磷酸酯(无色)；p-NP为对硝基苯酚(黄色),总结,一、动物水平筛选 模型： I型（链霉素诱导高血糖动物模型） II型（高脂饮食、PO大鼠） 药效评价： 血糖测定（葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、血糖仪） 糖耐量试验； 胰岛素释放试验； 胰岛素敏感性试验(葡糖钳技术),二、细胞水平筛选 葡萄糖消耗、转运试验三、酶和受体水平筛选 a-糖苷酶抑制剂 PTP-1B抑制剂；,思考题：中药多糖会不会升高血糖？,
