1、广东医学院2004级研究生,开题报告,Survivin与鼻咽癌放射残存细胞 Tr-12放射抵抗的关系探讨,研究生： 毕 宏 导 师： 孙 宁教授 时 间： 2005年8月20日,立题依据,立题依据,放射治疗是鼻咽癌的首选治疗手段，但放射后5年生存率较低，局部复发和远处转移是放疗失败的原因。放射后存活细胞对放射的抵抗是放疗后复发和转移的基础。明确放射抵抗的机理可提高放疗的局部控制率和完全缓解率。,立题依据,研究证明肿瘤细胞对放射的反应主要受基因控制 在受放射细胞中DNA链断裂，伴有细胞周期、生长因子、信号转导、基因表达的改变 照射存活后代放射抵抗机制可能与：凋亡减少;增殖减慢;DNA损伤修复能力
2、增强有关,survivin基因,Survivin是IAPs家族中分子量最小但抗凋亡能力最强而倍受关注的明星分子 位于染色体17q25，全长15kb，含4个外显子，3个内含子，编码分子量为16.5kD的蛋白质羧基末端缺乏环指结构 ，氨基端只含有一个包含保守的Cys/His 的BIR功能区,Survivin的组织分布,胚胎和胎儿组织中大量表达，分化成熟的正常组织无表达特异性地表达于多数肿瘤组织,survivin基因的主要功能,抑制凋亡Caspase途径：caspase-3/7非caspase途径：NFB,survivin基因的主要功能,参与细胞周期调控 特异性地表达于G2/M期,survivin基
3、因的主要功能,参与血管的生成参与DNA损伤后修复,survivin参与肿瘤放疗抵抗的机制,参与放射引起肿瘤细胞DNA损伤修复的调节,survivin参与肿瘤放疗抵抗的机制,阻滞细胞周期于放射不敏感期,survivin参与肿瘤放疗抵抗的机制,阻止自发性和放射诱导性凋亡,以Survivin为靶点的肿瘤放射增敏,Survivin核酶 Pennati等用靶向Survivin的锤头状核酶作用于两个过表达Survivin的黑色素瘤细胞株 ，-射线照射后，与亲代细胞相比，表达核酶的细胞克隆形成率下降，caspase-3活性提高，凋亡水平增加,以Survivin为靶点的肿瘤放射增敏,Survivin反义寡核苷
4、酸 Cao等在肺癌小鼠模型中，瞬时转染survivin与XIAP的反义寡核苷酸能显著下调它们的表达，反义治疗联合放疗组的移植瘤出现了超过15天的生长延迟,以Survivin为靶点的肿瘤放射增敏,siRNA干扰 Kappler等以survivin siRNA转染肉瘤细胞，发现survivin表达明显下降，且肿瘤细胞的放射敏感性随照射剂量的增加而增加。,姜黄素放射增敏的研究进展,姜科姜黄属植物姜黄Curcuma longa L(Cdomestica Valet)是一种常用中药，药用其根茎 抗炎抗氧化抗凝降血脂 抗动脉粥样硬化及抗肿瘤,姜黄素放射增敏的研究进展,我室黄小军、曹璋的实验已证明姜黄素通过
5、改变细胞周期对鼻咽癌放射抵抗细胞的增敏作用,创新之处,探讨survivin与鼻咽癌细胞放射抵抗的关系以及姜黄素对survivin表达的影响，为鼻咽癌的放射增敏提供理论依据,研究目标,研究目标,探讨survivin的表达与鼻咽癌细胞放射抵抗的关系，姜黄素作用对survivin表达及放射敏感性的影响，为鼻咽癌预后的判断，放疗后复发的治疗及放射增敏提供理论指导,研究目标,对比慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状细胞癌及放疗后复发鼻咽癌survivin及caspase-3蛋白表达，,研究内容,研究内容,CNE-2Z及其放射残存细胞tr12的培养。分别检测两个细胞株的自发凋亡水平，然后施以不同剂量(暂定为2、4、
6、8、10Gy)的照射，培养一定时间后用hoechst33342/PI双染法检测凋亡水平；RT-PCR检测survivin的mRNA水平；比色法测caspase-3的活性变化,研究内容,收集慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本各20例，用MSP法测fhit基因甲基化是否存在及甲基化率，用免疫组织化学法测PKC的表达。,研究内容,对Tr-12细胞做姜黄素的细胞毒实验（MTT法），取低毒性剂量联合照射（不同剂量）作用于Tr-12细胞，设对照组、单纯加药组、药物联合放射组、单纯放射组。各组细胞用克隆形成实验绘制放射-存活曲线；RT-PCR检测survivin的mRNA水平，免疫细胞
7、化学检测survivin和caspase-3的表达,研究内容,收集慢性鼻咽炎、鼻咽分化性非角化型鳞状细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本各30例，免疫组化检测survivin与caspase-3蛋白的表达,技术路线,一、实验病理部分,CNE-2Z细胞培养,Tr-12细胞培养,姜黄素细胞毒实验(MTT),不同剂量照射,空白对照组,空白对照组,不同剂量照射,姜黄素加照射,姜黄素阈下剂量,克隆形成实验,RT-PCR测survivin ,caspase-3mRNA水平比色法测caspase-3活性hoechst/PI双染测凋亡水平免疫细胞化学测survivin caspase-3蛋白表达,二、临床病理部分,
8、慢性鼻咽炎,鼻咽分化性非角化型鳞状细胞癌,放疗后复发鼻咽癌,Survivin蛋白表达 免疫组化,Caspase-3蛋白表达免疫组化,拟解决的关键问题,CNE-2Z及其放射残存细胞tr-12的培养。放射后复发的鼻咽癌标本的收集。,预期结果,预期结果,照射前和不同剂量照射后Tr-12细胞株中survivin的表达明显高于CNE-2Z；caspase-3的活性在CNE-2Z中比Tr-12中高；hoechst/PI双染法测凋亡水平在CNE-2Z中高于Tr-12,预期结果,姜黄素一定浓度作用于Tr-12后，survivin的表达低于作用前，照射与姜黄素联合组比单纯照射组的存活分数低，免疫细化显示surv
9、ivin的表达也比单纯照射组低。慢性鼻咽炎中survivin表达几乎为零，鼻咽低分化鳞癌中survivin表达水平低于放疗后复发的鼻咽癌，caspase-3的表达与survivin呈反相关。,经费预算,细胞培养基本材料及放射费 2000元 caspase-3活性检测 2000元免疫组化试剂 2000元 hoechst/PI双染 3000元 姜黄素 1000元,进度安排,2006年3月至2006年5月培养细胞，免疫组化预实验及石蜡标本中survivin、caspase-3表达的检测。2006年6月至2006年10月，对细胞照射，检测survivin的mRNA水平，caspase-3活性，细胞凋亡水平。2006年11月至2006年12月测姜黄素的放射增敏作用。2007年1月至2007年3月整理数据，撰写论文,请各位老师同学批评指正,
