1、,HPLC在药代动力学中的应用,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS分析,结果分析, By:花生PPTer ,主要内容, By:花生PPTer ,药物代谢动力学（Pharmacokinetic，PK）是定量研究药物在生物体内吸收Absorption、分布Distribution、代谢Mechanism和排泄Excretion规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律的一门学科。,机体对药物的作用, By:花生PPTer ,不同剂型对药物吸收的影响不同人种（或人群）对药物代谢的影响不同人群对药物排泄的影响,指导药物开发,指导后期临床试验,指导临床合理用药, By:花生PPTe
2、r ,吸收（absorption）：药物自给药部位进入血液循环的过程。消化道吸收（口腔，胃肠道吸收）消化道外吸收（注射，呼吸道，皮肤粘膜吸收） 顺序：静脉、吸入、腹腔注射、舌下含化、肌肉注射、皮下注射、口服、直肠给药、外敷。, By:花生PPTer ,吸收入血的药物随血流转运到各组织器官的过程。, By:花生PPTer ,药物在体内发生化学结构改变的过程意义：1、利于药物排泄 2、改变药理活性：, By:花生PPTer ,药物及代谢物从排泄或分泌器官排出体外的过程。肾脏（主要） 肠 肺 皮肤 唾液 乳汁等, By:花生PPTer ,反应药物经历转运、转化，血药浓度（量）随着时间（时）的推移而发
3、生变化的动态规律。描述这一规律的曲线, By:花生PPTer ,在传统中药药代学的研究中，76%的报道中使用了HPLC/MS/MS技术，24%使用了HPLC/ESI-MS技术。灵敏，快速，选择性高，效率高中药的有效成分中药材不同药材中同一成分,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS分析,结果分析, By:花生PPTer ,主要内容, By:花生PPTer ,液相色谱法串联质谱法同时 测定黄芩素，黄芩甙，木蝴蝶素A和汉黄芩素在大鼠血浆中的含量, By:花生PPTer ,本次实验，是利用液相色谱法串联质谱法，快速，准确地测出大鼠血浆中的黄芩素，黄芩甙，木蝴蝶素A和汉黄芩素含量，以解释其药代动
4、力学性质。, By:花生PPTer ,是一种多年生草本植物栽培黄芩inKorea。这种植物的根在传统的东方医学治疗各种疾病,包括发烧,溃疡、炎症和癌症。含有黄芩各种各样的黄酮,phenylethanoids、氨基酸、植物固醇和精油。黄芩苷,黄芩甙元oroxyiln和汉黄芩素(图1)是黄芩的主要有效成分这些类黄酮具有抗过敏2、抗氧化剂(3、4),抗艾滋病毒(5、6),抗炎7,抗肿瘤(8 - 10),抗焦虑药11,12和antigenotoxic anti-hepatitis B病毒活动13。, By:花生PPTer ,黄芩是一种多年生草本植物，它的根在传统的东方医学中被用于治疗各种疾病，包括发热
5、，溃疡，炎症和癌症。它含有各类黄酮，氨基酸，植物固醇和精油，其中的主要活性成分是黄芩苷，黄芩甙，木蝴蝶素A和汉黄芩素，它们具有抗氧化，抗过敏，抗病毒，抗焦虑等有显著的作用。, By:花生PPTer ,黄芩甙元、汉黄芩素和木蝴蝶素的分离我们之前的方法13,以及他们的纯度是99.0%。黄芩苷是从西格玛化工有限公司(圣。路易斯,密苏里州,美国)。2 -(3、4-Dimethoxy-phenyl)5、7-dihydroxychromen -4号(DPDC,纯度为99.0%,内部标准)是由东亚药业有限公司(龙仁市、韩国)。甲醇和乙酸乙酯(高效液相色谱级)获得Burdick &杰克逊Inc .(美国MI马
6、斯基根)和其他化学物质是最高质量的, By:花生PPTer ,分别将baicalein, baicalin, oroxylin A,wogonin的原溶液和DPDC加入DMSO中，DPDC的添加量为1mg/1ml。 将原溶液用乙腈稀释，得到工作溶液. DPDC溶液（0.1微克/毫升）由储备的等量溶液经乙腈稀释得到。 所有的已配置好的溶液都在聚丙烯小试管中避光置于4下一周。, By:花生PPTer ,通过将将工作溶液按比例配置，得到含量分别为5, 10, 20, 50, 100, 200 and 500 ng/ml的baicalein, oroxylin A,wogonin大鼠血浆标准液和含量分
7、别为5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 and 5000 ng/ml的baicalin大鼠血浆标准液。 通过分别将25微升0.24, 2.40,8.00微克/ml工作溶液添加到475微升大鼠血浆中，得到12.0, 120 和 400 ng/ml的QC溶液 最后将各配置溶液以50微升，分别置于聚丙烯小试管中，并保存于-20直到分析开始。, By:花生PPTer ,50个单位的大鼠血浆和QC样品标准混合10 l 10%抗坏血酸是一种抗氧化剂(31日),0.05的350 l mhydrochloric酸、5 l DPDC乙腈解决方案和1000 l在1.5
8、 ml-polypropylene乙酸乙酯管的混合物在13000g centrifuged 5分钟。有机层是pipette-transferred和蒸发使用真空干燥集中器。残留的溶解在40 l sonicating 3分钟,50%的甲醇centrifuged。aliquots(10 l)注入质/女士系统。, By:花生PPTer ,取50毫升大鼠血浆标准液，并混合以QC和10微升10%抗坏血酸作为抗氧化剂。再加入350微升0.05M盐酸，5微升DPDC于乙腈溶液中，并加入1000微升乙酸乙酯于1.5ml的聚丙烯小管中。混合物离心（13000xg）5分钟。分离有机层并干燥。溶解残渣于40微升50
9、%甲醇并静置3分钟，再度离心。取上清液10微升加入LC-MS/ms系统。,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS分析,结果分析, By:花生PPTer ,主要内容, By:花生PPTer ,色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性定量功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。,安捷伦液相色谱/离子阱质谱系统,在线真空脱气机,二元或四元梯度液相泵,自动进样器,柱温箱,二极管阵列检测器, By:花生PPTer ,（分离、定量和定性） 黄芩苷，千层纸素A和汉黄芩素，大鼠血浆中黄芩活性成分的测定。 经过液液萃取与2 - （3,4
10、- 二甲氧基 - 苯基）-5,7 - 二羟基 - 色烯-4 - 酮作为内标物，黄芩素，黄芩，千层纸素A和汉黄芩素是从一个洗脱色谱柱C18于7分钟，由甲醇和0.1甲酸的等度流动相柱（60:40， V / V） 。被检测的分析物使用电喷雾电离串联质谱在多反应监测（MRM）模式。, By:花生PPTer ,LC-MS/MS分析 色谱系统由NANOSPACE的 SI-2泵（高压输液泵），SI-2自动进样器和一个S-MC系统控制器，固定相C18柱（5微米，2.1mm内径100mm），流动相使用甲醇的混合物中， 并0.1甲酸（60:40，V / V），流速0.2毫升/分钟，色谱柱和自动进样器托盘温度分别为
11、50C和4C，时间为7.0分钟，洗脱液被直接引入串联的正电离电喷雾源四极杆质谱仪。,ESI是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于液相色谱-质谱联用仪。它既作为液相色谱和质谱仪之间的接口装置，同时又是电离装置。它的主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷嘴。最内层是液相色谱流出物，外层是喷射气，喷射气常采用大流量的氮气，其作用是使喷出的液体容易分散成微滴。另外，在喷嘴的斜前方还有一个补助气喷嘴，补助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。在微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来。离子产生后，借助于喷嘴与锥孔之间的电压，穿过取样孔进入分析器。加到喷嘴上的电压可
12、以是正，也可以是负。通过调节极性，可以得到正或负离子的质谱。产物离子被转换为采用量化。, By:花生PPTer ,锥电压分别为35V的黄芩素，33V的千层纸素A和汉黄芩素28V的黄芩苷和55V的DPDC。（？）Multiplereaction- 监测（MRM）模式下使用的特定前体/产物离子被转换为采用量化。,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS分析,结果分析, By:花生PPTer ,主要内容,baicalein, oroxylin A, wogonin and DPDC（三种待测物与内参物）的电喷雾电离产生丰富的质子化分子离子（ MH + ）为质荷比（m / z） ：271.2 ，
13、285.3 ， 285.3和315.0 ，,这些碎片离子被生产作为突出的产品离子分别是：黄芩素M / Z 123 （三羟基苯基部分） ， M / Z 271 （黄芩MH +离子损失葡萄糖醛酸部分），M / Z 270汉黄芩素（MH +离子损失甲基） ，对于M / Z 270 （MH +离子损失甲基基团）千层纸素A和M / Z 299 （MH +离子损失甲基基团）为DPDC 。, By:花生PPTer ,用该色谱法分离黄芩素，黄芩苷，千层纸素A和汉黄芩素的保留时间是约4.36 ， 2.59 ，5.17和6.17分钟，良好的分辨这四个类黄酮。,校准曲线是通过浓缩，得到黄芩素，千层纸素A和汉黄芩素范
14、围和黄芩苷浓度为5.0-5000纳克/毫升的大鼠血浆。对于低CV值（CV=方差/均值）黄芩素（ 3.6 ） ，黄芩（ 5.7 ）的斜坡上，千层纸素A（ 2.6 ）和汉黄芩素（3.0）所表示的方法的可重复性（表1） 。,服务管理,Service management, By:花生PPTer ,批内和批间CV值分别为：黄芩素0.8-6.1 ，千层纸素为一1.7-5.2 ，汉黄芩素1.4-5.9 ，黄芩苷1.6-4.1 。日内和批间的RE值为-4.0至4.2的黄芩素（baicalein）， -1.3至1.7千层纸素A（oroxylin A）和-3.8-5.8汉黄芩素（ wogonin）， -1.7-
15、1.7黄芩苷（baicalin）。这些结果表明本方法具有可接受的准确性和精确度。(如Table 2),服务管理,Service management, By:花生PPTer ,提取回收黄芩素，黄芩苷，千层纸素A和汉黄芩素的加标大鼠血浆测定采用一步法液 - 液萃取，用乙酸乙酯在酸性pH浓度为15.0 ， 75.0和在400纳克/毫升重复六次。回收率分别为黄芩素82.8-87.1 ，黄芩苷和71.1-76.9 ，千层纸素为一81.5-83.2 汉黄芩素为81.4-84.7 （表3） 。 DPDC的回收率为76.3 4.7 。,服务管理,Service management, By:花生PPTer
16、,加工稳定性（冻融和短期）和色谱法（再注入）进行了测试，并证明是影响不大（表4） QC样品，通过去3次冻融循环显示出可接受的准确度（RE：-5.85.3）和精密度（CVs：6.0）。QCs显示可接受的准确度（RE：-5.03.3）和精密度（变异系数：5.9）时，暴露在室温下4小时紫外线屏蔽下的灯光。的重组的再分析在4c下贮存24小时提取物表现出可接受的精度（RE：-7.83.0）和精确度（变异系数：3.9）的质量控制样本。,服务管理,Service management, By:花生PPTer ,此法已成功地用于药物动力学。如右图所示：图4显示的平均血浆黄芩素，黄芩苷，千层纸素A和汉黄芩素的浓
17、度随时间变化的曲线。,如右图所示可看出：AUC,t1/2,MRT,Vss andCl of baicalein were 32.14.9g min/ml, 31677.1 min,11811.2 min, 15.33.59 l/kg and 12920.2 ml/min/kg, By:花生PPTer ,结论 这一种灵敏，可靠的LC-MS/MS法同时测定黄芩素，黄芩苷，千层纸素A和汉黄芩素大鼠血浆中已研制成功并验证使用液 - 液萃取作为样品的处理步骤。这种检测方法被证明了可以接受的灵敏度（ LLOQ ：5.0纳克/毫升） ，精确度，准确度，选择性恢复和稳定性。该方法已成功应用于药物动力学黄芩素，黄芩苷，千层纸素A和汉黄芩素的静脉给药到雄性SD大鼠的黄芩研究中。, By:花生PPTer ,谢谢,2011级药学,
