1、第五部分 胚胎生物技术四、配子与胚胎冷冻保存五、胚胎移植六、性别控制,配子与胚胎冷冻保存,概念：配子与胚胎冷冻是指采用抗冻保护剂对配子或胚胎进行脱水处理，再经过降温程序使胚胎最终在-196条件下停止代谢活动，条件适宜时解冻并使其恢复活力的技术。 意义：建立配子库、胚胎库；保护生物多样性和珍惜濒危动物遗传资源；遗传资源及动物模型的国际范围内运输；避免运输过程中携带细菌或病毒。,原理：细胞代谢活动与温度脱水过程抗冻保护剂冰晶与抗冻保护剂毒性/渗透压打击之间的平衡,细胞代谢活动与温度： 配子及胚胎的自身活力和代谢活动直接受温度变化的影响，当处于超低温（-196摄氏度）时，代谢活动完全停止，处于静止状
2、态，当在适宜条件下温度升高后又可以恢复活性。 脱水过程： 配子或胚胎冷冻保存事实上是一个脱水过程，当配子或胚胎处于高渗溶液中，细胞内的水分通过细胞膜外流，当环境渗透压足够大或胚胎暴露时间足够长时，细胞内的水分充分外流，从而在冷冻过程中避免或减少冰晶的形成。,抗冻保护剂： 通常在冷冻液中添加抗冻保护剂形成高渗，细胞内水分外流的同时，抗冻保护剂内流至配子或胚胎细胞内，抗冻剂存在使溶液的冰点降低，使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出，避免形成冰晶。但抗冻剂具有毒性，尤其在高浓度和高温情况下毒性更大。 冰晶与抗冻保护剂毒性/渗透压打击之间的平衡： 冷冻过程中除了冰晶、抗冻剂毒性外，还要考虑渗透压打击。
3、因此冷冻成功与否就在于在冰晶和抗冻剂毒性和渗透压打击之间的平衡点。抗冻保护剂浓度越高、处理时间越长脱水越彻底，但毒性和渗透压打击越大。,抗冻保护剂的种类： 1、小分子渗透性抗冻保护剂 甘油、乙二醇、丙二醇、DMSO等 2、大分子非渗透性抗冻保护剂 蔗糖、聚蔗糖、棉子糖，麦芽糖，海藻糖等 3、卵黄（sperm）,冷冻保存及解冻方法,一、精液 二、卵子或胚胎,一、精液冷冻： 小分子渗透冷冻保护剂（甘油）+卵黄，液氮蒸气熏蒸或干冰冷冻,细管冻精,颗粒冻精,精液冷冻步骤：,采精 精液品质检查 精液的稀释 精液保存,（一）、采精：定义：借助特定的器械将雄性的精液采集出来的技术。（一）假阴道法 Artif
4、icial vagina （牛、羊）（二）手握法和筒握法 A gloved hand （猪）（三）按摩法采精 Massage method （犬、鸡）（四）电刺激采精法 Electroejaculation（野生动物和丧失交配能力但种用价值高的公畜）,（二）精液品质鉴定： 1、外观： 颜色： 一般为乳白色或灰白色。正常牛羊精液呈乳白色或乳黄色，猪、马的精液呈淡乳白色或浅灰白色。,2、性状：云雾状 浓份精液因精子密度大、活力强，使精液翻腾呈现旋涡云雾状。3、pH值： 牛、羊精液pH值为6.5-6.9, 猪、马为 7.4-7.5。一般同种精液pH值较低的品质较好。4、杂质： 如被毛、脱落上皮、炎性
5、分泌物、灰尘、纤丝。,5、精子活率检查 精子活率：在显微镜下观察，在一个视野内向直线前进运动的精子占全部精子总数的百分率。一般在37-38C温度下进行评定，牛、羊精液尚需用生理盐水作稀释后才能评定。 活力一般用0-1.0的10级评分，一般新鲜采精液活率应该为0.70.8左右。,6、精子密度的检查精子密度：是指单位体积（ml）精液内所含有的精子数。,目测：在低倍显微镜下根据精子之间的距离来定，分为密、中和稀三等。,7、精子的形态检查精子畸形率：头部、颈部、尾部，观察200个精子， 求出比例。用于输精的精子畸形率不得超过20%。头部：巨大，细小，缺失，双头，轮廓不明显，皱缩颈部：臌大，纤细，弯曲，
6、不全，原生质滴尾部：屈折，带原生质滴，双尾，折断，纤细,双头和双尾精子,8、精子顶体异常率 顶体与精子受精能力直接有关，牛超过14%，猪超过4.3%，显著降低受精率。,(三)、精液稀释液,细管 A一液：2.9柠檬酸钠液100.0mL，卵黄10.0mL。 二液：取一液41.75mL加果糖2.5g，甘油7.0mL。 B脱脂牛奶83.0mL，卵黄10.0mL，甘油7.0mL。 颗粒 A12.0蔗糖液75.0mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。 B0.11乳糖液75mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。 C2.9柠檬酸钠液73.0mL，卵黄20.0mL，甘油7.0mL。 D. Tris 3.44
7、 g，柠檬酸1.83 g，果糖1.26 g，卵黄15%，甘油5%。 所有稀释液每100.0mL中添加青、链霉素各10万单位，现配现用。,精液稀释方法,1、一次稀释法： 将采出的精液用含有甘油的同温稀释液按比例一次加入（常用于颗粒精液）。2、二次稀释法： 将采出的精液用不含有甘油的常温稀释液一按精液品质稀释，放入4 平衡，然后加入等温的含甘油的第二液，加入量等于第一次稀释的精液量（常用于细管精液）。,降温和平衡（预冷）,稀释后的精液，采用逐渐降温法。在11.5小时内，使稀释精液的温度降到45；然后再在同温的恒温容器内平衡24小时。,（四）、精液冷冻保存方法： 1、颗粒精液 2、细管精液,颗粒冻精
8、方法,所需器械：采用聚四氟乙烯板（简称氟板）、铜纱网、尼龙网或铝板均可。 程序：在装有液氮的容器上置一铜纱网，距液氮面厘米左右，使温度维持在-80至-100。将平衡后的精液用滴管按一定量（每毫升稀释精液，滴冻101粒，滴管应事先预冷 ）滴于铜纱网、滴完最后一滴，熏蒸分钟后，当精液颗粒颜色变白时，立即浸入液氮，并将全部颗粒取下，收集于贮精瓶或纱网布袋内，并做好标记，然后立即移入液氮罐中贮存。,细管冻精方法,所需仪器：细管灌封一体机（NFA-S1，富士平工业株式会社） 简易方法：用1ml注射器（把200L取样枪头从中间剪开，将尖头部插入注射器头部）将精液吸入0.25 mL的细管内，管尾部留约1cm
9、的空间，以备封口用，然后用PVC粉末封口，记号标识。 冷冻程序：将装好精液的细管装入金属架式网盒中，放入冷冻,在距离液氮上方5cm熏蒸15min后浸入液氮里保存.,精液质量控制（国标）,1、剂量： a. 细管：中型0.5毫升；微型0.25毫升。 b. 颗粒：0.10.01毫升。2、精子活力解冻后活力，指呈直线前进运动的精子百分率（下限）30（即0.3）；精子复苏率（下限）50。3、 每一剂量解冻后呈直线前进运动的精子数细管：每支（下限）1000万个。颗粒：每粒（下限）1200万个。4、 解冻后的精子畸形率（上限）20。5、 解冻后的精子顶体完整率（下限）40。6、 解冻后的精液无病原性微生物，
10、每毫升中细菌菌落数（上限）1000个。 7、 解冻后的精子存活时间在58贮存时（下限）为12小时；在37贮存时（下限）4小时。牛冷冻精液必须符合上述各项指标。否则，不得使用。,2、卵子或胚胎冷冻保存 小分子渗透冷冻保护剂+大分子非渗透性冷冻保护剂 程序冷冻 玻璃化冷冻,1、冷冻胚胎的选择： 用于冷冻保存的胚胎必须是形态良好的、发育正常 的高质量胚胎，可以通过超数排卵及人工授精和体外受 精获得。,2、程序冷冻： 1、10%甘油或乙二醇+0.25M Sucrose，程序降温1/min，形成冰晶。 2、程序：抗冻保护剂的添加、程序降温、植冰、解冻、 防冻剂的去除,冷冻保护剂的添加（程序化冷冻)： 可
11、采用多步法或一步法。胚胎移入冷冻保护液需平衡一段时间，以保证保护剂完全渗入细胞内。平衡时间的长短视胚胎和冷冻保护剂渗透情况而定。冷冻前胚胎长期接触保护剂会产生毒害作用，一般平衡时间10-30分钟。,（牛冷冻液：PBS+20%FCS+10%甘油（乙二醇）+0.25M蔗糖）,胚胎装管： 将平衡好的胚胎移入冷冻液中，然后将胚胎装入冷冻管内。,降温程序：慢速冷冻：室温 -7 -30 液氮 1/分 植冰 0.3 /分,冷冻速度 a. 在胚胎冷冻的早期研究中，大多采用慢速冷冻，以保证胚胎脱水充分，避免形成冰晶。 b.快速冷冻方法的建立使冷冻程序更为简单、方便。,3、玻璃化冷冻OPS(Open Pulled
12、 Straw)法： 1）、35%-40%的抗冻保护剂（乙二醇、DMSO），迅速投入液氮，降温速率3000/min，形成玻璃化状态，不形成冰晶 。 2）、程序：抗冻保护剂的添加、快速降温、解冻、防冻剂的去除,OPS法冷冻程序：VS1: TCM199+20%FCS+10%EG+10%DMSO (1分钟)VS2: TCM199+20%FCS+20%EG+20%DMSO （25秒）39条件下完成。,将直径为0.5mm的毛细玻璃管(长9cm)或冷冻细管拉至直径和管壁厚度均为原来的一半，从中间切断。,4、 胚胎保存温度 一般细胞长时间保存需要-130以下的温度。液氮（-196）既可以满足这一条件，且使用上
13、安全方便。大量实验证明，胚胎可以在液氮中保存多年。,5、 解冻和冷冻保护剂的去除 解冻：将胚胎从液氮中取出，通过一定程序恢复到室温。 冷冻保护液为含有非渗透性冷冻保护剂的溶液，以避免渗透压的迅速变化对胚胎造成的损伤。解冻后的胚胎需在此液中停留一段时间以除去渗透性冷冻保护剂。,6、解冻和去保护剂过程 慢速解冻：20/分 快速解冻：360-500/分，30-37水浴 解冻时，将装有胚胎的冷冻管从液氮罐中取出，在室温下停留10秒，然后放入30水浴40秒，用消毒的干纱布擦净管，剪断细管两头，将胚胎和冷冻保护剂倒入解冻液中，6-7分钟后移入培养液，洗涤3次后培养。（程序冷冻的解冻方法）,从液氮中取出已冻
14、存的OPS管，手指堵住OPS管尾，管尖端插入解冻液中，胚胎和冷冻液被转移到解冻液1中，停留5min后转入解冻液2，再停留5min，最后移入培养液，洗涤3次后培养。（OPS的解冻方法）,防冻剂去除过程也有多步法和一步法。常规冷冻法：PBS+20%FCS+0.25M蔗糖。OPS法：a. TCM199+20%FCS+0.3M蔗糖（5分钟） b. TCM199+20%FCS+0.15M蔗糖（5分钟） 或直接进入TCM199+20%FCS+0.25蔗糖中进行移植。,第五部分 胚胎生物技术四、配子与胚胎冷冻保存五、胚胎移植六、性别控制,胚胎移植,手术法胚胎移植（小鼠、羊）非手术法的胚胎移植（牛）,家畜胚胎
15、移植操作步骤,供、受体的选择供体的超数排卵与人工授精受体的同期发情胚胎的收集胚胎的检查和评定胚胎的移植,牛胚胎移植示意图,牛非手术胚 胎移 植 示 意 图,所需器械：移植枪,1 、受体牛在发情后68天之间均可进行移植（发情之时定为0小时）。移植前对受体牛进行直肠触摸，检查黄体是否合格。合格者用于移植。 2、 在移植之前必须先进行尾椎硬膜外麻醉 ，擦拭外阴部。 3、 对照供体牛采胚记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配受体和胚胎。 4、 解冻胚胎。 5、 重新将胚胎装入0.25ml塑料细管（直接解冻移植法不需要重新装管）。 6、 细管装入移植枪。 7、 把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧
16、，再套上软外套。 8、 将胚胎移植到受体黄体侧的子宫角大弯处。 9、 做好受体移植记录。,非手术法胚胎移植操作步骤（牛）,手术法移植（羊和小鼠） 在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，然后用注射器或移植管将含有胚胎的培养液注入到子宫角内或输卵管内。,超数排卵技术,超排定义： 在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称“超排”。,牛、羊有PG+FSH法和CIDR(或海绵栓)+FSH法两种；也有用PMSG.发情后913天开始；常用的激素为FSH
17、；注射方法一般是连续4d递减注射,每天2次,间隔12小时（半衰期短）；发情后812小时配种，间隔12小时再配种一次。,超数排卵方法：,（发情911天）FSHPG法牛超数排卵,早FSH1.5mg （国产，7.5mg/瓶） 晚FSH1.5mg,早FSH1.0mg 晚FSH1.0mg,早FSH0.6mg + PGF24ml（0.4mg） 晚FSH0.6mg,早 FSH0.4mg 晚FSH0.4mg,2448h发情后配种或输精两次，每隔6h输一次(为0d)（细管：1000万精子，颗粒1200万精子）,第67d冲洗子宫（尾椎麻醉：盐酸利度卡因100mg/5ml2）,桑椹胚早期囊胚,FSHCIDRPG法牛
18、超排,发情周期任意一天埋置CIDR,10d后取出CIDR，埋入第二个CIDR（为第0d）,第5d 早FSH 晚FSH,第6d 早FSH 晚FSH,第7d 早FSH 晚FSH,第8d早 FSHPGF2（取出CIDR，注PGF2 ） 晚FSH,2448h发情，配种或输精（为第0d）,第67d冲洗子宫，获桑椹胚早期囊胚,*澳大利亚产FSH总剂量306mg；日本产FSH24AU（量递减）,PMSG法牛超数排卵,PGF2消除黄体,发情第1617d，注射PMSG15003000IU,隔日注射 hCG10001500IU,2448h发情，配种或输精（为第0d）,第67d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚,PMSG
19、法牛超数排卵,FSHPG法羊超数排卵,早 FSH（国产，7.5mg/瓶） 晚FSH,早 FSH 晚FSH,早 FSH + PGF22ml 晚FSH,2448h发情，配种或输精两次（为第0d）,发情周期第1213d（绵羊）、1618d（山羊）,第6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚,同时静脉注射LH100150IU,*国产FSH总量为150300IU,FSHCIDR法羊超数排卵,发情周期任意1d阴道埋置CIDR （为第1d）,第10d换第二个CIDR,第16、17、18d 早FSH 晚FSH,第19d早 FSH（取出CIDR） 晚FSH,2448h发情，配种或输精（为第0d）,第6d冲洗子宫，获桑椹
20、胚早期囊胚,第4d注射progcstin,*进口FSH经产羊总剂量7.04mg/只，育成羊5.28mg/只，等量注射,PMSG法羊超数排卵,发情周期的 1213d（绵羊）、 第1618d（山羊）注射PMSG8001500IU,2448h发情，配种或输精（为第0d）同时注射hCG500750IU,第6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚,牛非手术法收集胚胎示意图,不同发育阶段的正常牛胚胎,发情后天数,发育阶段,桑椹胚早期囊胚,性别决定与控制,性别决定原理性别鉴定技术性别控制技术,哺乳动物性别控制原理 染色体性别决定：Y染色体决定雄性 18世纪90年代，半翅目，精细胞观察，一半精细胞多一段染色体。 19
21、02年，Maclung提出模型：性别是由这一附加染色体决定的。这样，性别也就在受精时由精子的染色体决定了。 1906年，Wilson称这条染色体为X染色体，以后又在无X染色体的精母细胞中发现了一条更小的附加染色体，定名为Y染色体。 1959年，人和小鼠中发现了Y染色体与雄性决定相关。 1966年，Y染色体短臂与雄性发育相关。 在Y染色体短臂上寻找TDF（Testis-determining factor），通过遗传、生物化学、分子生物学，尤其是对突变体的分析和研究，使TDF的搜索范围越来越小。 1989年，Palmer发现四位XX男性，拥有35-40kb的Y染色体特异性片段，将这一特异性片段经
22、数次重叠克隆酶切，制成了50个0.5-1.0kb的小探针，分别与人、牛、小鼠等Y特异DNA进行杂交，其中一个探针杂交成功，位于假常染色体区边缘5kb处，命名为Y-染色体性别决定区（sex-determining region of Y chromosome, SRY）。,SRY基因在不同物种之间高度保守SRY就是TDF SRY表达与睾丸分化相关。 SRY转基因小鼠（XX）表现为雄性发育和性行为。 XY女性的SRY突变分析。,哺乳动物性别鉴定技术,1、性染色体分析鉴定胚胎性别(核型分析)2、X-连接酶法鉴定胚胎性别 （X染色体失活之前，XX胚胎的X-连接酶表达量是XY胚胎的二倍，如葡萄糖-6-磷
23、酸脱氢酶或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）3、H-Y抗原法鉴定胚胎性别（雄性特异）4、SRY-PCR法鉴定哺乳动物胚胎性别,哺乳动物性别控制技术,X、Y精子分离控制动物性别,X、Y精子分离方法,1、离心分离法：X精子的DNA含量比Y精子高，导致X精子的质量和密度大于Y精子，离心时X精子沉降速度比Y精子快。2、电泳分离法：根据X精子和Y精子表面电荷的差异，进行分离，但结果不稳定。3、免疫法：用适合的抗体与Y精子表面特有的H-Y抗原结合，使Y 精子失活而得到X精子。4、流式细胞分离法： X精子所含有DNA比Y精子多,流式细胞分离精子流程示意图,流式细胞仪分离精子的原理,精子在Hoechest33342染色
24、后，通过流式细胞仪时液流与激光交截，精子上的荧光染料Hoechest33342被氩离子紫外激光（350nm）激发，产生蓝色激发光（460nm）。由于X精子所含有DNA比Y精子多，其结合上的Hoechest33342就相对比较多，所激发出的荧光会比Y更强。荧光信号通过光电倍增管探测并转变成电信号，传递给流式细胞仪的信息处理芯片，由它迅速根据DNA含量的差别分辨出哪个是X精子哪个是Y精子，处理得到的信息又迅速反馈回到液流上，使之充上正电荷或者负电荷。同时由于喷嘴产生高频率的震动，喷射出的液柱也就形成一滴滴包含有X精子或者Y精子并且带有正电荷或者负电荷的液滴，液滴的两旁放置有电极，产生高压电场。这样，携带不同电荷的液滴在电场作用力的引导下，落入左右两旁的收集容器中， X精子和Y精子得以分离。,流式细胞仪X/Y精子分离实效图,国外（精子分离速度30004500个/秒）,国内（精子分离速度50007000个/秒）,性控奶牛母犊群,澳亚国际牧场,昭君牧场,旭日牧场,
