1、2018年7月30日,药物分析,主讲: 罗容珍,Pharmaceutical Analysis,第十四章 维生素类药物的分析,2018年7月30日,维生素类药物的分析,维生素,维持人类机体正常代谢功能所必须的一类活性物质,主要用于机体的能量转移和代谢调节,体内不能合成,须从食物中摄取。,通俗来讲，即维持生命的物质，是维持人体生命活动必须的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但不可或缺。,2018年7月30日,维生素类药物的分析,维生素,醇,从化学结构上来讲，维生素类均属于有机化合物，但并非同一类化合物。,酯,酸,胺,酚,醛,各具有不同的理化性质和生理作用,20
2、18年7月30日,按溶解度分,2018年7月30日,维生素类药物的分析方法,生物法,微生物法,化学法,物理化学法,都是依据药物的化学结构、理化性质与生物特性来进行分析,2018年7月30日,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,主要讲解,2018年7月30日,维生素A的分析,维生素A,是一种不饱和脂肪醇，在自然蜀中主要来源于鲛类海鱼肝脏中提取的脂肪油（鱼肝油）。,鲛类海鱼？,具有多种异构体，有不同的名称，其中活性最好的是维生素A1，也是通常所指的维生素A,2018年7月30日,维生素A的分析,维生素A,具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体,2018年7月30日,维
3、生素A的分析,维生素A,具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体,维生素A醇（Retinol),2018年7月30日,维生素A的分析,维生素A,具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体,维生素A醋酸酯（Vitamin A Acetate),2018年7月30日,维生素A的分析,维生素A,具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体,维生素A棕榈酸酯（Vitamin A Palmitate),2018年7月30日,维生素A的分析,维生素A,具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体,去氢维生素A（A2 dehydroretinol),2018年7月30日,维生素A的分析,维生素
4、A,具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯，具有多个异构体,去水维生素A（A3 anhydroretinol),2018年7月30日,第一节 VitA,Retinol (Vit A alcohol),VA acetate,VA palmitate,2-Cis Neovitamin Aa 4-Cis Neovitamin Ab2,4-dicis Neovitamin Ac6-Cis Isovitamin Aa,2018年7月30日,第一节 VitA,二、主要性质,溶解性:与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。 不稳定性：含有多个不饱和键，性质不稳定，易被被空气中氧或氧化剂
5、氧化，易被紫外光裂解，特别是在加热和金属离子存在时更易氧化变质从而失活。 紫外吸收：共轭多烯醇侧链结构，在325-328nm之间有最大吸收，可用于鉴别 与三氯化锑呈色:三氯甲烷+三氯化锑=不稳定的蓝色,2018年7月30日,第一节 VitA,二、鉴别试验,1.三氯化锑反应(Carr-Price反应),书上的有点小错误,2018年7月30日,第一节 VitA,二、鉴别试验,反应应在无水无醇条件下进行。因为水可使三氯化锑水解，而乙醇可以使碳正离子作用而使反应不能进行,Notice,2018年7月30日,第一节 VitA,2.UV,Vit A,Vit A3,维生素A在无水乙醇盐酸溶液中溶解,立即进行
6、UV扫描,在360nm处有一最大吸收峰.如1.水浴加热30s,迅速冷却,此过程发生脱水反应,扫描时出现三个吸收峰,2018年7月30日,第一节 VitA,2.UV,Vit A,Vit A3,3.TLC：三氯化锑显色，磷钼酸显色,维生素A,去水维生素A,最大吸收峰向长波方向移动：红移,2018年7月30日,三、含量测定,维生素A的测定CHP收载三种,HPLC法,UV,三氯化锑法,2018年7月30日,三、含量测定,UV,维生素A常混有杂质，包括多种异构体，氧化降解产物，合成中间体，副产物等以及常用稀释油类。都有紫外吸收，干扰测定。,咋办呢？,请用三点校正法！,2018年7月30日,第一节 Vit
7、A,维生素A在325-328nm的波长范围内具有最大吸收，其最大吸收峰的位置随溶剂的不同而异。如下：,应用三点校正法时要注意,2018年7月30日,第一节 VitA,A,nm,Vit A sample,pure VA acetate,impurities,测定原理,杂质的吸收在310 340 nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（假设） 物质对光的吸收具有加和性。（真理）,2018年7月30日,第一节 VitA,第一法等波长差法,2,1,3,328,340,316,A1,A2,A3,A1,A2,A3,X1,X2,X3,设：,已知,A1=A1-X1=A1-(m1+C),A2=A2
8、-X2=A2-(m2+C),A3=A3-X3=A3-(m3+C),VitA醋酸酯,Y=mX+C,2018年7月30日,第一节 VitA,第一法等波长差法,2,1,3,328,340,316,A1,A2,A3,A1,A2,A3,X1,X2,X3,A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340),VitA醋酸酯,经过一系列变换,得出下式,通过实验求出A1、A2、A3，再用纯品求出K1、K2，再转换,波长为chp2010药典规定,2018年7月30日,第二法等吸收比法,第一节 VitA,310,325,334,A2=A3=6/7A1,A1,A2,A3,A2,A1,A3,F,L,D,M,E
9、,A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334,VitA醇,波长为chp2010药典规定,2018年7月30日,测定方法,一、基本步骤,第一步：选择A （A328 或A328(校正后)）,选择依据所选A值中杂质的干扰已基本消除,第二步：求,第三步：求效价（每克供试品所含维生素A的国际单位数）,规定,具体步骤,测定A,2018年7月30日,测定方法,1IU=0.344g Vit A 醋酸酯,1gVit A 醋酸酯=106 g/0.344 (g/IU) =2.907106IU,Vit A 醋酸酯换算因子 =2.907106 IU/1530 =1900,2018年7月
10、30日,第四步：求标示量(百分),测定方法,Why?,2018年7月30日,第四步：求标示量,测定方法,这是因为标示量是以效价的形式存在的,2018年7月30日,第四步：求标示量,测定方法,测定含量,单位质量1g对应的效价,效价占单位样品质量的百分比,效价占单位质量的百分比,经过变形可得下式,2018年7月30日,第四步：求标示量,测定方法,这是因为标示量是以效价的形式存在的,2018年7月30日,二、第一法纯度高的VitA acetate,测定方法,max应为328nm。,若max不在326329nm之间，则不能用本法测定，改为第二法,A值的选择,测量吸光度,判断,2018年7月30日,测定
11、方法,A. 若【(A/A328nm)-规定值】 (0.02) A328不校正,B. 若【(A/A328nm)-规定值】 有超过 (0.02)者,A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340),2018年7月30日,测定方法,三、第二法VitA alcohol,皂化法 6/7法, 样品前处理,酯 乙醚提取VA醇，洗涤，过滤异丙醇溶解残渣,在 300，310，325，334nm处分别测Ai,max应为325nm。,若max不在323327nm之间，则供试品中杂质含量过高，改为色谱法将未皂化部分纯化后进行测定。,2018年7月30日,测定方法,A. 若(A300/A325) 0.73,
12、A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334,B. 若(A300/A325) 0.73色谱法纯化后再测,2018年7月30日,测定方法,应用示例一,VitAD胶丸中VitA的含量测定,精密称取本品(规格10,000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物 0.1287g 至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度如下，计算Vit A的标示量百分含量。,2018年7月30日,测定方法,A=A32
13、8校正,2018年7月30日,测定方法,2018年7月30日,测定方法,应用示例二,称取Vit A滴剂0.1082g(标示量50 000I.U./g)，加环已烷至50.0ml，取出5.0ml置于另一50 ml量瓶中，加环已烷至刻度，摇匀后置石英比色皿中，以环已烷为空白，分别于以下波长处测得相应的吸收度值，试求此滴剂中Vit A的标示量百分率：,2018年7月30日,A=A328校正,测定方法,2018年7月30日,测定方法,2018年7月30日,第一节 VitA,(二)HPLC,RF-HPLC同时测定人血清中Vit A和Vit E含量,色谱条件,色谱柱：C18 流动相：甲醇-水 流速：1.2m
14、l/min 检测波长与AUFS： 08min(330nm,0.25AUFS); 8min后(292nm,0.05AUFS) 内标：Vit A 酯,Vit A,Vit E,2018年7月30日,(三)三氯化锑比色法,第一节 VitA,max 618nm620nm,2018年7月30日,习题,1. 药典中的杂质检查按照操作方法不同可分为下列三种类型 对照法 、 灵敏度法 、 比较法 。,2018年7月30日,习题,2. 药物中存在的杂质，主要来源于两个方面，即 和 。,2018年7月30日,习题,3. 药物中微量的氯化物在 酸性条件下与 反应，生成氯化银的胶体微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠
15、溶液（浓度为 ）在相同条件下产生的氯化银浑浊程度比较，判断供试品中氯化物是否符合限量规定。,2018年7月30日,习题,4.巴比妥类药物具有的特性为：A. 弱碱性 B. 弱酸性 C. 易与重金属离子络合D. 易水解 E. 具有紫外特征吸收,2018年7月30日,习题,5. 苯巴比妥钠与铜盐的鉴别反应生成物为:A. 紫色 B. 绿色 C. 蓝色 D. 黄色 E. 紫堇色,2018年7月30日,习题,6巴比妥类药物在吡啶溶液中与铜吡啶试液作用，生成配位化合物，显绿色的药物是:A. 苯巴比妥 B. 异戊巴比妥 C. 司可巴比妥 D. 巴比妥 E. 硫喷妥钠,2018年7月30日,习题,7. 巴比妥类
16、药物的鉴别方法有:A. 与钡盐反应生成白色化合物B. 与镁盐反应生成红色化合物C. 与银盐反应生成白色沉淀D. 与铜盐反应生成有色产物E. 与氢氧化钠反应生成白色沉淀,2018年7月30日,习题,8. 于Na2CO3溶液中加AgNO3试液，开始生成白色沉淀经振摇即溶解，继续加AgNO3试液，生成的沉淀则不再溶解，该药物应是: A. 盐酸可待因 B. 咖啡因 C. 新霉素 D. 维生素C E. 苯巴比妥,2018年7月30日,习题,9. 与NaNO2H2SO4反应生成橙黄至橙红色产物的药物是: A. 苯巴比妥 B. 司可巴比妥 C. 巴比妥 D. 硫喷妥钠 E. 硫酸奎宁,2018年7月30日,
17、习题,10. 银量法测定苯巴比妥钠含量时,若用自身指示法来判断终点,样品消耗标准溶液的摩尔比应为: A. 1:2 B. 2:1 C. 1:1 D. 1:4 E. 以上都不对,2018年7月30日,习题,11. 用酸量法测定巴比妥类药物含量时，适用的溶剂为: A. 碱性 B. 水 C. 酸水 D. 醇水 E. 以上都不对,2018年7月30日,第二节 VitB,亦称盐酸硫胺,具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能，主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病,氨基嘧啶环,噻唑环,亚甲基,季铵,2018年7月30日,第二节 VitB,性质,噻唑环,溶解性,季铵,干燥品在空气中迅速吸收4%的水分。
18、在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶，水溶液呈酸性,2018年7月30日,第二节 VitB,性质,硫色素反应,噻唑环在碱性介质中可开环，再与嘧啶环上的氨基环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈蓝色荧光,2018年7月30日,第二节 VitB,性质,分子中具有两个杂环，可与某些生物碱沉淀试剂如碘化钾、三硝基苯酚、碘溶液、硅钨酸反应生成恒定的沉淀,紫外吸收特性,2018年7月30日,第二节 VitB,性质,维生素B1为盐酸盐，可呈氯化物的鉴别反应,氯化物的特征,2018年7月30日,第二节 VitB,一、Identification,1.硫色素荧光反应为维生素B1所特
19、有,H2O,2018年7月30日,溶于丁醇，显蓝色荧光,第二节 VitB,2018年7月30日,第二节 VitB,取本品约5mg，加NaOH T.S. 2.5ml溶解后，加铁氰化钾 T.S. 0.5ml与正丁醇5ml，强力振摇2min，放置使分层，上层显强烈的蓝色荧光；加酸使呈酸性，荧光即消失；再加碱使呈碱性，荧光又重现。,方法,2018年7月30日,第二节 VitB,沉淀反应,维生素B1与碘化汞钾生成淡黄色沉淀B.H2HgI4,维生素B1与苦酮酸生成扇形白色结晶,维生素B1与碘生成红色沉淀B.HI.I2,维生素B1与硅钨酸反应生成白色沉淀B2.SiO2(OH)2.12WO3.4H2O,201
20、8年7月30日,氯化物反应,本品是盐酸盐,水溶液呈氯化物的鉴别反应,硫元素反应,2018年7月30日,红外分光光度法,本品,对照品,对照,2018年7月30日,第二节 VitB,三、含量测定,非水溶液滴定法 (Non-aqueous Titrimetry) 紫外分光光度法 (UV) 硫色素荧光法 (Thiochrone Fluoremetry),2018年7月30日,第二节 VitB,三、含量测定,非水滴定法原理,维生素B1分子中含有两个碱性的已成盐的伯胺和季铵基团,在非水溶液中均可与高氯酸作用,以电位指示终点.根据消耗的高氯酸量即可算出维生素B1的含量.,2018年7月30日,第二节 Vit
21、B,1. Non-aqueous Titrimetry,喹那啶红亚甲蓝 （紫红天蓝）,2018年7月30日,第二节 VitB,紫外分光光度法原理,维生素B1分子中含有共轭双键结构,在紫外区有吸收,根据最大吸收波长处的吸光度即可以计算含量.,2018年7月30日,第二节 VitB,2. UV,10.1M HCl2H203H3PO4 buffer4alcohol,246,232,255,2018年7月30日,第二节 VitB,3. Thiochrone Fluoremetry,硫色素荧光法,2018年7月30日,第三节 VitC,烯二醇结构,共轭酸性强,酸性弱,内酯结构,2018年7月30日,第三
22、节 VitC,一、主要性质,溶解性 酸性 旋光性 还原性,L-抗坏血酸,(有生物活性),L-二酮古罗糖酸,L-去氢抗坏血酸,无生物活性,2018年7月30日,第三节 VitC,水解性,糖类性质,50,UV,2018年7月30日,第三节 VitC,二、鉴别,1.与AgNO3反应,2.与2,6-二氯靛酚反应,氧化型,还原型,酸式色碱式色,3.与氧化剂反应,2018年7月30日,第三节 VitC,4.与糖类反应,H2O,其它还有薄层色谱法,百分吸收系数法,2018年7月30日,杂质检查,溶液的澄清度与颜色检查维生素C长期贮存会被氧化变色,因而应通过此项检查控制其纯度.铁与铜离子的检查维生素C中可能存
23、在一些铁与铜离子,因而可以采用标准添加对照法进行检查.草酸的检查一般加CaCl2形成草酸钙对测定其浊度.,2018年7月30日,三、含量测定(强还原性),第三节 VitC,1.碘量法,取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6,2018年7月30日,2. 2,6-二氯靛酚滴定法,第三节 VitC,快速滴定，用于含Vit C的制剂与食品分析,3.HPLC,人血浆中Vit C浓度的HPLC法测定,201
24、8年7月30日,第三节 VitC,标准溶液制备：取V C对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加10%偏磷酸稀释至刻度，得维生素C储备液浓度为1mg/ml，置冰箱中2保存，3日内可用。血浆样品预处理：取受试者静脉血，立即置肝素化的离心试管中，3000rpm离心5min；取血浆0.5ml，加入0.5ml 10%偏磷酸溶液，涡旋混合0.5min，离心，分取上清液，置冰箱2贮存，直至测定。稳定性考察：V C在血浆中不稳定，在5%偏磷酸溶液中也难以保持长期稳定，应尽可能缩短药物分离和处理时间。样品测定：每天抽取的血样应当日测定，每天建立一条标准曲线，并随行测定高、中、低浓度的双样本质控样品。,
25、2018年7月30日,第四节 Vit D,胆甾醇,7-脱氢胆甾醇,维生素 D3,维生素 D2,麦角甾醇,甾醇衍生物,2018年7月30日,第四节 Vit D,维生素D2 维生素D3,溶解性:在三氯甲烷中极易溶解,在丙酮乙醇乙醚中易溶. 不稳定性:双键极不稳定,易氧化变色,毒性增强. 旋光性:有五到六个手性碳原子,均具有旋光性. 显色反应:在三氯甲烷+醋酐+硫酸会从黄到紫再到绿色. 紫外吸收:具有吸收基团,2018年7月30日,第四节 Vit D,二、鉴别,显色反应:,三氯甲烷+醋酐+硫酸,三氯甲烷+三氯化锑,三氯化铁=橙黄色,初显黄色逐渐变红迅即变紫最后变绿,溶液显橙红色,逐渐变粉红色,二氯丙
26、醇和乙酰氯=绿色,2018年7月30日,第四节 Vit D,二、鉴别,比旋度鉴别,测定比旋度进行鉴别,其它鉴别法,TLCHPLC熔点UVIR等,2018年7月30日,第四节 Vit D,三、杂质检查,1、麦角醇的检查90乙醇溶解后，加洋地黄皂苷溶液，放置18h，不得发生浑浊。2、前维生素D的光照产物280nm320nm,2018年7月30日,第四节 Vit D,Ch.P 2010NP-HPLC,含量测定,USP34-NF29,化学法,色谱法,微生物法,BP2010,化学法,色谱法,光谱法,2018年7月30日,固定相：硅胶 流动相：正己烷正戊醇（997：3） 检测波长：254nm,第一法：用于
27、无维生素A醇及其他干扰的供试品第二法：(1)皂化提取 ;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D，得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。第三法：当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维生素D峰仍受干扰时，采用此法。,第四节 Vit D,2018年7月30日,第五节 Vit E,苯并二氢吡喃醇,Vit E (dl-Tocopheryl Acetate),Synthetic Natural,2018年7月30日,苯并二氢吡喃环 + 饱和烃链,第五节 Vit E,溶解性 水解性 氧化性 紫外吸收,二、鉴别,1.硝酸反应,2018年7月30日,第五节 Vit E,2.三氯化铁反应,2018年7
28、月30日,第五节 Vit E,4.三氯化铁反应,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）,显色剂 硫酸（105 5）,VitE Rf = 0.7,2018年7月30日,第五节 Vit E,三、杂质检查,1.酸度2.生育酚,取Vit E 0.1g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺T.S.1滴，用硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)不得过1.0ml,2018年7月30日,第五节 Vit E,四、含量测定,载气N2固定液硅酮（OV-17）担体硅藻土或高分子多孔小球柱温265检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标正三十二烷 n 500 R2,1.GC
29、Ch.P,USP 内标 十六酸十六醇酯 R1.0,2018年7月30日,内标液 取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液,对照液 精密称取VitE对照品0.2011g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取 13l注入GC仪，测定，计算校正因子,供试液 精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取13l注入GC仪，测定，计算含量。,已知：对照液测得A对=297456，A内=797469； 供试液测得A样=296513，A内=805741;,第五节 Vit E,本品含C31H52O3应为96.0 102.0%,2
30、018年7月30日,第五节 Vit E,2018年7月30日,第五节 Vit E,2.HPLCJP,样品 dl生育酚固定相十八烷基硅烷键合硅胶流动相甲醇-水（49 ：1）检测波长292nm R2.6 RSD0.8%,3.FLD同步荧光扫描法,2018年7月30日,第六节 复方制剂中维生素的分析,一、离子对HPLC测定维生素,色谱柱ODS流动相A: MeOH:H2O=(200:800)含1.1615g樟脑磺酸 B: MeOH检测波长脂溶性:280nm；水溶性:272nm内标苯酚水溶性维生素供试液配制 取维生素片粉，精密称定，置棕色量瓶中，加DMPS 100l，内标液5ml，流动相A溶解稀释至刻度
31、，摇匀，过滤，备用。水溶性维生素供试液配制 取维生素片粉，精密称定，置棕色量瓶中，加DMPS 100l，甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，过滤，备用,离子对试剂,水溶性,脂溶性,抗氧剂,2018年7月30日,第六节 复方制剂中维生素的分析,二、RP-HPLC测定水溶性维生素,色谱柱ODS流动相A: buffer(0.05M KH2PO4,0.2% 三乙胺,pH6.0):ACN =(97:3) B: MeOH梯度洗脱程序(0min)A:B(90:10) (20min)A:B(60:40) (30min)A:B(90:10)流速1.0ml/min检测波长210nm柱温室温,2018年7月30日,第六节 复方制剂中维生素的分析,三、非水RP-HPLC测定脂溶性维生素,色谱柱ODS流动相ACN:MeOH=(80:20) 流速1.0ml/min检测波长265nm,
