细胞超微标技术.ppt

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资源描述

1、细胞超微标记示踪技术,前言,近十几年来,国际上创造出许多细胞超微标记与示踪的细胞化学新技术,因而可以进一步定性、定位和定量地分析某些特定的化学成分、物质结构及其功能意义。用各种高电子密度的离子、分子或颗粒显示组织、细胞的通透性、孔径、通道或屏障以及某种带负电荷结构。,IF: 12.186 (2011),Chithrani et al. Nano Lett. 2006,Dependence of cellular uptake of gold nanoparticles as a function of size,The graph of number of gold nanoparticles

2、 per vesicle diameter vs nanoparticle size,Chithrani et al. Nano Lett. 2006,(B-F) TEM images of gold nanoparticles with sizes 14, 30, 50, 74, and 100 nmtrapped inside vesicles of a HeLa cell, respectively.,正常细胞与纳米材料的表面形态,ZnO NPs附着于胶质细胞表面引起质膜表面囊泡结构的产生,细胞表面囊泡增加,ZnO材料与细胞膜发生相互作用,TiO2 P25导致星形胶质细胞膜表面囊泡的聚集

3、,TiO2 P25 6h,TiO2 P25 12h,TiO2聚集于细胞表面,细胞表面大量囊泡结构,第一节 超微标记示踪技术的分类和评价,非特异性标记示踪技术(一)重金属真溶液标记(二)阳离子染料(三)酶与金属蛋白类特异性标记示踪技术(一)弥散性标记物(二)颗粒性标记物,第一节 超微标记示踪技术的分类和评价,一、 非特异性标记示踪技术(一)重金属真溶液标记 如钌红、硝酸镧以及葡萄糖酸亚铁等化合物中的重金属,分子小,电子致密度高,所标记的生物标本可以在电镜下观察和研究某种组织、细胞的通透性。这些重金属盐可以通过细胞连结和缝隙连接的小管,进入细胞间隙和相邻细胞,但不能进入完整、未受损伤的细胞。(二)

4、阳离子染料 如阳离子铁蛋白,着染带有负电荷的结构。(三)酶与金属蛋白类 主要是辣根过氧化物和铁蛋白。前者用辣根过氧化物酶(HRP)注入机体的细胞、组织或器官,再用3.3-氨基联苯胺(DAB)与其进行组织化学反应而产生显色物质。该产物强嗜锇,因而电镜下也能着色示踪。多用于研究小蛋白的追踪、通透性及神经通路。铁蛋白也可用来示踪研究通透性。,二、特异性标示技术(一)弥散性标记物 1. 放射自显影术 2. 酶标记抗体或特异性复合物 3. 可溶性(非标记)酶和抗酶复合物(PAP) 4. 生物素和卵白素(Biotin-avidin)复合标记(二)颗粒性标记物1. 铁蛋白标记复合物;2. 各种微球体标记物3

5、. 生物大分子标记物,如-2巨球蛋白;4. 金标记复合物 作为一项理想的技术方法,应具有多功能、多用途,既能用于透射电镜,也能用于扫描电镜和X线衍射分析。金标记技术能满足这些要求,是很有价值的标记示踪技术。,磁性荧光多功能复合微球制备原理图,Fe3O4纳米粒子的TEM图,Fe3O4 SiO2 的透射电镜TEM图,第二节 铁蛋白标记技术,铁蛋白是含铁的大分子,电子密度高,分子量为500,000 800,000。分子核心是磷酸羟化铁,外包蛋白质壳,总直径小于12 nm。透射电镜下为高电子密度的细小颗粒。一、离子化铁蛋白技术: 是一种非特异性标记技术,利用阳离子化铁蛋白和阴离子化铁蛋白标记细胞中具有

6、负电荷或正电荷的结构。二、铁蛋白标记抗体的免疫电镜技术: 细胞与铁蛋白标记的抗体共同孵育、染色、包埋、超薄切片。在透射电镜下借助于铁蛋白的高电子密度,可以精确地、特异地显示出相应抗原的位置、分布。若用铁蛋白标记配体或其他物质,则可以显示、研究膜受体及膜特性。 此法的缺点是制备繁杂困难,铁蛋白颗粒过于细小不便观察,超薄切片上非特异性反应很强。,亲和细胞化学技术和糖基化铁蛋白技术的应用。亲和细胞化学技术的基本原理是将铁蛋白与生物素交联,利用生物素对卵白蛋白的高亲和力、以生物素卵白蛋白配体(或抗体)为桥,将铁蛋白标记在细胞的特定结构或物质上,以观察细胞超微结构及化学性质。使用生物素卵白蛋白标记技术的

7、优点是方法灵敏,非特异性低,亲和力极强,可以进行双重或多重标记,简单方便,可以仅制备保存一种标记卵白素或标记生物素,而进行多种反应,以显示多种特定的物质结构。,第三节 金微粒(胶体金)标记技术,一、金标记技术的优点:1. 胶体金的制备容易、简单、便宜2. 几乎不出现非特异性吸附、标记3. 可用不同的试剂和浓度严格控制所需金微粒的大小4. 能用多种方法定量分析标记到细胞表面的金微粒5. 胶体金可以与抗体、多糖、外源凝集素和其他多种蛋白质相连,生成标记大分子而不影响大分子的生物活性,用途广泛6. 可用于扫描电镜和X线衍射分析,这是其他标记物无法比拟的,二、胶体金的特性、稳定性基标记原理 胶体金的特

8、性主要取决于金微粒的直径、吸收光谱及其稳定性。金微粒的大小可以用透射电镜直接测定。国际上通用的标示方法如WGA-Au5。胶体金是一种疏水胶体,由吸附的周围离子云维持胶体的稳定性。胶体金的稳定性取决于胶体粒子的大小,颗粒越小越稳定,越不容易受电解质的干扰而凝聚。,目前已有三种稳定金属胶体溶液防止凝聚的方法。(1)胶体颗粒表面吸附表面活性物质(如肥皂)以增加表面电荷密度及潜能。(2) 吸附亲水大分子以降低粒子间的吸引力。(3)吸附高分子多聚体以增加胶体溶液的立体稳定性。 此外,多糖和其他多聚物也能提高其立体稳定性。,典型样品的透射电子显微镜图 (a) Fe3O4; (b) 氨基化Fe3O4; (c

9、) 胶体金; (d) Fe3O4/Au (15-20 nm),王显祥等,科学通报. 2009; 54(4):430-435,直径1620 nm的胶体金的制备: 用干净非金属药勺和容器称氯金酸50 mg,溶于500 ml三蒸水中,制成0.01%的氯金酸液,煮沸,快速加入1%枸掾酸钠12.5 ml,边加边搅拌边加热,至5 min左右溶液由黄、蓝,变成深红色。冷却后用碳酸钾溶液调pH。注意: 玻璃器皿应非常洁净,实际加入的次序要正确,应用高纯度的去离子水。 注意颜色的变化: 电镜下金微粒应为圆球形或椭圆形的电子致密颗粒,不得有微粒的聚集凝结,而应完全呈现单个分散状态。可在无菌或特殊处理情况下保存数月

10、。,四、金标记物的制备,(一)制备大分子被标记物中含有无机盐时,会降低胶体颗粒间的排斥电荷,招致胶体凝聚或影响大分子的吸附和标记,为此,需对金标记的大分子进行纯化或透析。(二)金微粒标记先要测定标记大分子最适宜的标记量、最适宜pH,以求得最佳的标记效果和最稳定的金标记物溶液。此外,金和大分子蛋白间的等电点有关,蛋白质与金结合的最佳点是在等电点或稍微偏碱。若胶体金的pH不合适、胶体金颗粒太大,被标记物质的分子过小、数量过少,则易引起金粒凝集。这时可用小牛血清白蛋白与小肽交联后,在进行金标记。,五、胶体金标记物的应用和研究,(一)光镜中的应用标记物在光镜下为桔红色。金标IgG在普通光镜下计数组织、

11、细胞。应用Au-rhodamine ConA-avidin 复合物对同一细胞进行光镜、荧光镜、电镜的联合观察。若标本用金标记染色后再经银染,灵敏度更高。 (二)扫描电镜中的应用这是金标记的优点之一。因金微粒有很强的发射二次电子的能力,故可以扫描电镜观察金标记物在细胞表面的分布。此外,用不同大小的金微粒,还可进行多重标记。,(三) 透射电镜中的应用 在透射电镜下,以将特异性金标记法用于研究病毒、细菌、细胞、骨髓细胞、肝细胞神经组织等,显示细胞表面物质或细胞内部的物质结构。 常用的金微粒是Au5和Au20。 金标记可分为直接法和间接法。 直接标记法是用金标记物直接标记细胞结构。一般说来,标记在细胞

12、表面的金微粒数量,随着金微粒的直径的增大而减小。 间接标记的反应程序是标本先用第一抗体血清处理后,再用金标蛋白A或金标第二抗血清处理。用间接法标记的B淋巴细胞较直接法标记的要强,非特异性要低。这可能是间接法可以提供更多的空间结合点之故。,(四) 超薄切片的金标记法,胶体金是单一均质微粒胶体,可以根据要求制备出不同规格、适合超薄切片的多重标记。用金标记超薄切片,需要戊二醛固定标本,环氧树脂包埋。 用直接法时,将超薄切片裱到铜网上,或者将铜网漂浮在金标液表面、室温下反应0.53 h,有时金标液中加入少许小牛血清白蛋白,以进一步减少非特异性吸附。 间接法是将带有切片的铜网先与特异性抗血清在室温下孵育

13、2 h或4下24 h,缓冲液冲洗后再用金标记物室温孵育10 min2 h,清洗后再用常规电镜处理。目前有几种间接法:,切片先用外源凝集素处理,然后与金标记多糖或糖蛋白孵育,显示外源凝集素多糖或糖蛋白的标记定位。该法较直接法反应强,非特异性吸附少,但较麻烦,每次要制备所用的金标溶液。金蛋白A法。该法根据蛋白A能特异结合到各种IgG的FC段,制备了一种金-蛋白A标记液,使用各种不同的IgG抗血清,可显示各种相应的细胞抗原。需选择合适的抗血清滴度或用金标记免疫球蛋白替代金标蛋白A。根据抗原抗体双价结合原理,可用金标记的抗原检测特异抗体。用微过量的2价抗体与组织细胞反应,使该2价抗体仅有一个抗原结合部

14、分与组织抗原结合,剩余的抗原结合部分将与加入的金标抗原结合,显示某种抗原的定位。但有非特异性吸附。,(4) 金标记的其他应用金标记还可用于测定细胞的凝集性,结合免疫蚀刻研究红细胞表面的抗原立体分布、血管的通透性、神经末梢的选择性结合、摄入和逆向运输、溶酶体和红细胞的X线微量分析等。,图 生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解,(5)金标记的定量及其分布测定细胞表面的金标记结构有几种方法:诸如分光光度计,放射测定、X线分析等。由于金微粒特别是2075 nm者,能大量吸收可见光(max 525550 nm),因此可以用分光光度计测出结合在细胞表面的金微粒的数量和结合常数。如:红细胞表面可结合16

15、,000个大豆凝集素-Au17颗粒、结合常数为5.6x109 mol-1/L;神经氨酸酶处理红细胞后,每个细胞表面的金标记物增加到42,000,但结合常数不变。其他几种金标记外源凝集素的结合常数大约为1010 mol-1/L左右。金微粒数量金标记物体积,应用实例,超顺磁性铁纳米颗粒标记对视网膜前体细胞体外培养的影响,Chen SY, et al. Int J Ophthalmol. 2008; 8(5): 913-915,研究背景,近年来,视网膜干细胞移植已经成为视神经变性和再生领域研究的热点之一,使以往认为无法治疗的理念得以更新 。但是,干细胞移植人体后,如何从受体辨别供体干细胞,并观察其在

16、体内的迁移变化情况,一直是让人困扰的问题。MR示踪技术在解决细胞活体示踪的难题上是行之有效的,它有效成像时间长,可观察细胞的动态迁徙过程,且空间、时间分辨率高,对比度好 。超顺磁性铁纳米颗粒(SPIO)是近年来研究发现的新型磁共振阴性对比剂,可在活体标记神经干细胞。示踪剂的应用是否会对供体视网膜干细胞的分化生长产生影响呢?,图1 A :原代细胞呈球形细胞团分布;B :标记成功细胞普鲁士蓝染色呈蓝色,图2 A :电镜显示含铁囊泡; B :细胞凋亡核固缩,表1 TUNEL细胞计数,图3 MTT细胞生长活性曲线,结果:当SPIO标记浓度低(22.4 mg/L)时符合MRI示踪要求,但标记物对细胞产生毒性,影响其生长;浓度11.216.8 mg/L时,既不影响细胞生长,也能达到较好的转染效率。结论:SPIO标记浓度在11.216.8 mg/L范围内时为最佳,标记效率较高且不影响细胞的体外分化培养。,

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