1、2018年7月30日星期一,LAMP技术及应用,湖北省疾控中心结防所周丽平,LAMP技术,环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸的指数级扩增的技术已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫)LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分枝杆菌诊断鉴别中世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案,“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术,LAMP
2、技术的原理 对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。,LAMP法使用的酶,链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。LAMP法使用最适温度65的聚合酶。,2018年7月30日星期一,LAMP法的引物设计,2018年7月30日星期一,LAMP法的原理,2018年7月30日星期一,LAMP法的原理,2018年7月30日星期一,LAMP技术特点,LAMP法和其他PCR法的比较,2018年7月30日星期一,LAMP法和其他PCR法的比
3、较,2018年7月30日星期一,LAMP法所需的试剂,2018年7月30日星期一,2018年7月30日星期一,LAMP技术简介,环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约65）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。,LAMP法常规操作步骤,2018年7月30日星期一,LAMP
4、法的检测方法,琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP扩增产物在2的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。（图A）肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行染色，来检测扩增是否发生。（图C）,2018年7月30日星期一,2018年7月30日星期一,LAMP法在结核菌检测中的
5、应用,2018年7月30日星期一,靶标限定: 结核分枝杆菌复合群,gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌。对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本，长远来说，更有利于避免耐药性的产生。,LAMP法在结核菌检测中的应用,2018年7月30日星期一,适宜的检测对象以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测对象，可避免假阳性过高。 反应管预装反应体系扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶污染；用户操
6、作简便、减少操作误差。结果易读产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。,技术特点：,LAMP法在结核菌检测中的应用,2018年7月30日星期一,临床试验, LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果,灵敏度89.54% 阳性结果预期值98.13% 特异性98.93% 阴性结果预期值93.77% 总符合率95.31%,LAMP法在结核菌检测中的应用,2018年7月30日星期一,临床试验, LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果,阳性一致率=88.56% 阴性一致率=93.06% 总符合率=91.36%,WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在已有肺结核症状的检测者中进行对比，T
7、B-LAMP法比痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。,2018年7月30日星期一,2018年7月30日星期一,LAMP法在结核菌检测中的应用,现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较,痰标本目测法检测流程,100分钟,一、样品处理,1、用23倍体积的4%NaOH溶液消化痰液2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中,一、样品处理,2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清,一、样品处理,3、沉淀用1mL生理盐水重悬洗涤,一、样品处理,4、13000r/min离
8、心10min，尽量吸弃上清5、重复步骤3、4一次,一、样品处理,6、向含沉淀物的离心管分别加入100L DNA提取液，混匀后沸水浴10min,一、样品处理,7、冷却至室温后， 13000 r/min离心5min，上清即为核酸模板,二、核酸扩增,1、向反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2.5L，注意加样时枪头要穿透稳定液层加至反应管大腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区,二、核酸扩增,2、置65恒温反应60min,三、结果判断,1、反应结束，将反应管倒置甩动2次，再正置甩动2次，使工作液与显色液充分混合,三、结果判断,2、在阴性对照反应管液体颜色为无色（或橙色），阳性对照反应管
9、液体颜色呈绿色的条件下： 若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性； 若待检样本反应管中液体颜色为无色（或橙色），则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性； 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。,（1）LAMP结果为阳性，涂片结果也为阳性。可做出患者疑似患有结核病的诊断，并开始抗结核治疗，同时等待培养结果。（2）LAMP结果阳性，而涂片结果为阴性。根据临床症状判断是否开始抗结核治疗，同时等待培养结果。这时可考虑增加一个或一个以上的标本进行LAMP检测以确认。如果增加的标本检测结果也为阳性，则患者可被初步诊断为患有结核病，并等待培养的结果。（3）LAMP结果为阴性，涂片结果为阳性。应考虑LAMP结果是否受痰标本中的抑制物影响，并增加一个或一个以上的标本检测。若增加的标本检测结果仍不变，且排除抑制物因素，则患者可初步考虑为非结核分枝杆菌感染，进行进一步确诊实验。（4）LAMP结果为阴性，涂片结果亦为阴性。根据临床症状判断是否开始抗结核治疗，并等待培养结果。（5）随访患者 LAMP结果阳性，不能作为随访患者的疗效评价。,LAMP检测结果的临床应用,2018年7月30日星期一,一点建议,谢 谢 !,2018年7月30日星期一,
