1、分子诊断技术平台的进展及展望,内 容病原体检测技术概述病原体核酸检测技术概述病原体核酸检测新技术应用核酸检测新技术存在问题及发展,背 景,治 疗,近10年新发传染病绝大多数是病毒引起,病毒与亚病毒6819种408属,动物病毒1917种204属,感染人296种37属,背景,背景,检测技术概述形态学（电镜）组织学（细胞培养）免疫学（ELISA,Western Blot, IF,NT,HI）分子生物学（PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR, Microarray,Sequencing）,传统检测方法的局限性 胶体金 （灵敏度 窗口期） ELISA （灵敏度 窗口期） PCR/RT-PCR （通量
2、 未知病原） Real-time PCR （通量 未知病原) 巣式PCR/RT-PCR (污染，电泳）,核酸扩增检测技术概述,核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。 核酸扩增技术可分为变温扩增技术和等温扩增技术。,变 温 扩 增,PCRRealtime PCRRT PCRNested PCRMultiplex PCRDigital PCR,等 温 扩 增,TMA/NASBASMARTHDASDA/NDARCA/MDALAMP/IMSARPA,基于T7 Promoter基于解旋酶基于链置换活性的DNA 聚合酶链置换和重组酶,核酸检测
3、新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,核酸检测技术发展趋势 未知病原 多病原 高通量 自动化 现场技术 (POCT),中 心 实 验 室 科 研 方 向 简 介,未知病原检测技术平台,高通量自动化工作站技术平台,多病原、症候群检测技术平台,现场检测技术平台,4,1,2,3,现场检测技术 - LAMP, IMSA多病原检/监测技术 - GeXP, Qiaxcel, RPM未知病原鉴定 - NGS，VIDISCA, RPM 自动化检测-
4、 Liquid handling system 生物信息学支持- VIP软件,检测/监测/鉴定技术平台,病毒检测/监测/签定技术平台及生物信息学,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,LAMP技术特点 特异性强: 2对引物配对6个区域或3对引物配对8个区域 灵敏度高： 10-100 copies 设备要求低: 不需要PCR仪器，65 水浴（等温） 检测快速： 1小时 操作简单： 一步法（单管） 结果判定方便：颜色（肉眼观察颜
5、色变化和沉淀） 吸光值（半定量，650nm比色） 普通琼脂糖电泳 浊度（浊度仪，实时监测，半定量）,实时荧光定量PCR仪,2小时,水浴、热块、PCR仪、浊度仪,电泳、浊度、颜色指示剂、肉眼观察,1小时,25￥/Reaction,仪器要求,实验结果,反应时间,实验成本,Realtime PCR 与 LAMP 特点比较,Realtime PCR,LAMP,VS,实时荧光定量PCR仪,50￥/Reaction,IMSA/EV71/CA16,JCM,2014, 52（6): 1862MERS (submitted),Gene, 2014, 541, 123-128,Food and enviromen
6、tal virology ,2014,GEAR/HRV,submitted,内容：LAMP检测技术应用于手足口病例的现场评价 合作单位：湖南、山东、河北省CDC 标本数量：手足口500份（每省）,LAMP 技术的现场评价,LAMP 技术现场评价,LAMP 检测技术应用于手足口病例的评价 (湖南)-Advances in Infect. Dis. 2012, 4(2) 110-118,肠道病毒EV71型核酸检测结果比较,肠道病毒CoxA16型核酸检测结果比较,小结临床标本515份EV71符合率100%CA16符合率99.6%参照：国产RealTime PCR 检测试剂盒,IMSA (Isothe
7、rmal Multiple Self-matching-initiated Amplification),目的：建立具有自主知识产权的等温多自配体 引发扩增反应 专利进入实质审查 引物设计软件：www.imsa-,IMSA 与 LAMP 的特点比较,IMSA 与 LAMP 方法检测手足口病结果,IMSA方法在常见传染病检测中的应用,IMSA法针对EV71和CVA16 检测的最低检测线：利用概率元分析法（probit analysis）,937,1039,1749,3266,67,108,149,430,JCM,2014, 52（6): 1862,IMSA 与 LAMP 方法检测手足口病临床标本
8、结果,IMSA法针对261份手足口临床标本的检测：以商业化qRT-PCR试剂盒检测结果为标准,IMSA法对手足口临床标本的检测，其诊断灵敏度要高于LAMP法,IMSA检测H7N9方法的建立及评估,5份临床标本的实验室检测验证 与国家流感中心结果（qPCR）相一致 卫生部临检中心的H7N9检测技术考核Panel 共计10份标本，结果全部符合，无漏检及误检 2013年12月末，参与广东省新发H7N9病例检测 结果符合，显色法结果判读准确 H7N9检测试剂盒转让北京爱普益生物科技有限公司,现场无仪器化提取核酸，发展直接法 多重检测 （含内参） 污染问题,存在问题,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/
9、RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,多重PCR检测技术 温度变化多重PCR (TSP) 基于DPO引物 溶解曲线 多色探针熔解曲线,BioPlex,-J. Clin. Microbiol 2012,50(2):288,手足口病相关病毒,J. Clin. Microbiol. 2012 ,50(7)：2384； BRI，2014， 648520,腹泻相关病毒,Temperature Switch PCR (TSP),GeXP, QIAxcel,BMC Micr
10、obiology.2013, 13:58,2013 , 8(4): e62126,BRI, 2013, 327620,研究结果,引物浓度调整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引物浓度；扩增体系选择三个退火温度调整，三个循环数调整，,研究结果：基于QIAxcel全自动电泳仪,两组中均加入Rnasep-DNA引物作为内参；,基于Qiaxcel的多重PCR检测技术,商业化,发热呼吸道症候群多种病原核酸检测培训班 -北京 2012. 05,“常见16种呼吸道病毒检测的多重PCR试剂盒”应用于十二五传染病重大专项发热伴呼吸道症候群监测项目,“常见16种呼吸道病毒检测的多重PCR试剂盒”应用于全国流感监测
11、网络部分实验室,呼吸道病毒多重PCR快速检测试剂盒,存在问题：病毒变异 （引物优化） 病毒地区差异 （引物优化） 结果判断 阳性对照 （16质粒/RNA） 增加病原体（流感亚型） 内参更换 （假病毒） 两管并一管（11种病毒） 流感耐药 ,基于熔解曲线分析的多重PCR检测技术,六种常见食源性细菌的检测,引物设计单引物单模板,多引物多模板及引物分组,3 沙门氏菌,3 副溶血弧菌,1 志贺氏菌,2 致泻性大肠杆菌,1 金黄色葡萄球菌,2 李斯特氏菌,1,2,2,3,3,1,十二种腹泻病原体的检测(submitted),核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nest
12、ed PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,one-step Real-Time nested RT-PCR(ORTN RT-PCR) (submitted),基于 TSP 设计的新型一步法巣式PCR 方法,实验设计： 一管四引物两退火温度,不同长度的内外引物退火温度不同引物浓度不同溶解曲线分析极高灵敏度,实验结果：熔解曲线&琼脂糖电泳,1（L1）：阴性样品。 2（L2）：阳性样品,实验结果：EV71 标准曲线图,本试验方法可用作EV71样品的定量分析，CT值可达到38.40，10倍于qPCR,新型一步法巣式
13、PCR与荧光定量探针法PCR和传统两步法巣式PCR比较（100份临床样品）,针对12例检测结果不同样品，采取重复试验并测序的方法验证新型一步法检测结果的准确性。,Advantages of digital PCR（优点）,Not rely on external references Increased tolerance to enzyme-inhibiting substances Simultaneous template amplification Superior precision, sensitivity and reproducibility lower coefficient
14、 of variation Reduced background DNA and contaminant levels which consequently increases the signal-to-noise ratio in positive reaction partitions,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,自动化高通量检测,Beckman Biomek NX/FX型实验室自动化工作站,主要特点：单臂或
15、双臂，96道、384道或智能八道加样器供选，24个微孔盘工作区，多种分注功能及配件定位器可选,未知病原检测,再测序芯片（RPM） PCR 阵列（PCR array) 二代测序 （NGS）,基于GCS 3000 TG系统的基因芯片再测序技术,未知病原RPM,完成4种不同症候群（呼吸道感染，7科23属；胃肠道感染，6科13属；脑炎和神经系统感染，6科17属；病毒性出血血热相关，4科10属）的相关病毒性病原体的全部引物和探针的生物信息学分析、设计和芯片定制（650片）和储备 建立了呼吸道感染和胃肠道感染再测序检测芯片技术平台,RPM-Flu3.1：FluA(35%)12种病毒21种细菌,RPM-IV
16、DC1：86种病毒亚型 22种细菌Plos One,2013 8(9) : e75704Frontier in Microbiology,2015(accepted),Resequencing Pathogen Microarray再测序芯片（RPM）,高通量自动化的脑炎症候群检测PCR Array方法,方法建立的基础 1：样品体积扩大,RNA,cDNA,方法所需样品量32L（16个孔）,方法建立的基础 2：96孔板的分配,特点：1.引物组在96孔板上的分布是模式化的。2.更快的分配体系。3.节省了样品编号的时间。,引物组可以安排在同一个整行或整列,也可以平均分配整行或者整列,肠道病毒,乙脑,
17、疱疹,腮腺炎,弹状病毒,副粘病毒,麻疹,西尼罗,蜱传脑炎,细菌16s,呼吸道合胞,风疹,布尼亚病毒,虫媒病毒,沙粒病毒,黄病毒,方法中所用的引物：200对+,来源再测序芯片的引物文献中查到的各个科室提供的根据每年流行情况不同，对引物组进行调整,特点：1.每个样品由16个不同的引物组检测2.整板的PCR产物都用同一对引物测序。,方法流程（24小时完成）,全自动电泳仪,RNA,cDNA,工作站加样与PCR,可以做成预制反应体系,获得电泳结果,获得sanger法测序结果,测序,阴性样本：做二代测序,结果分析,临床检测结果：儿童医院样品,阳性率：1996 (19.8%) 另有147份样本进行中,新一代
18、测序技术应用领域,携带者筛查,预处理,药理基因测试,产前监测,孕后监测,孕期监测,胚胎遗传学诊断,遗传疾病,肿瘤研究,肿瘤切除边缘,治疗状态监测,预后,复发检测,风险预警,早期检测,筛查,肿瘤诊断,设备平台,感染疾病,动物微生物研究,微生物定性,病毒载量监测,微生物定量,突变株鉴定,病毒整合,移植配型,鉴定和配型,组织排斥,全程监测,移植后排斥监测,以及更广阔的应用,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,可感染人病毒的发现时间曲线Woolhouse M E et al. Proc. R. Soc. B 2008;275:2111-2115,随着越来越多的病毒被发现了，其中可能
19、致病的病毒种类也随之增加。,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,临床样本,细菌,真菌,寄生虫,其他,病毒,临床宏基因组( Clinical Metagenomics),高通量测序,可以在不需要目标病原体的背景资料的情况下，一次高通量测序试验就可以完成检测工作。,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,临床样本,病毒检测如大海捞针,Oxford Nanopores disruptive MinION USB device (GridION),优化NGS应用于未知病原体筛查流程,NGS测序,病原体分离培养及鉴定,工作流程及时间点,* 从收样至病毒鉴定初步结论，共
20、计用时60小时。,十二五重大专项能力考核,筛查到的主要病毒基因组覆盖率,登革病毒I型基因组覆盖率,MERS-NGS应急工作,NGS Timeline,NGS Data Analysis by VIP Pipeline,MERS-CoV Genome Assembly,建立针对未知病毒鉴定的生物信息学分析方案 Virus Identification Pipeline(VIP),Advantages of VIP （优势）,Cross-platform support （交叉平台适用） (454, PGM, Illumina.etc) Ultrafast and accuracy （超快准确）
21、Low hardware requirements （硬件要求低） One-Touch command （一键式命令）,下一步工作目标： 挖掘NGS的潜力 vs 节约实验成本,大批量未知病毒测序工作,提高测序通量 & 降低实验成本,使用分子条码（barcode）,靶向建库及简化实验流程,硬件成本和人员要求高（不同需求） 标准化 （加强内部合作）结合临床数据（精准医学）,存 在 问 题,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,现场检测系统（POCT）,免疫学技术 上转发光 胶体金 免疫荧光核酸技术 定量PCR 微阵列 等温扩增,定量PCR,图 雅培公司生产的Abbott m2000 System,比利时Biocartis 公司的Idylla,多重定量PCR,图 illumipro-10自动化等温扩增和检测系统(应用于LAMP),图 BD公司Viper系统（应用于SDA）,微流控芯片（和国外合作）,国内商业化的核酸POCT是空白 交叉学科融合 产学研结合,存 在 问 题,
