1、干 细 胞 治 疗 肺 疾 病,2009年8月,朱建勇,郧阳医学院附属人民医院呼吸科,干细胞大事记,1967年，美国华盛顿大学的多纳尔托马斯发表报告称，如果将正常人的骨髓移植到病人体内，可以治疗造血功能障碍。1998年11月，美国威斯康星大学的科学家在美国科学杂志报告说，他们已成功地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖。1999年12月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。1999年12月，干细胞研究进展被科学杂志评选为该年度世界十大科学进展之首,内 容,干细胞基础知识干细
2、胞与肺部疾病的当前研究开展干细胞治疗肺疾病的思考,干细胞基础知识,干细胞(stem cell)：定义：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,按来源分类(1)胚胎干细胞：指胚胎早期的干细胞。这类干细胞分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力。如囊胚期内细胞团的细胞(2)成体干细胞：指成体各组织器官中的干细胞，具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻)组织器官组成的细胞。如骨髓造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肺干细胞等,干细胞分类（一）,干细胞分类（二）,根据其分化潜能大小，可分为三类全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能(如胚胎干细胞) 多能干细胞：具有分化出多种细胞
3、组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力。如骨髓造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞单能干细胞：只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞、肺干细胞,干细胞的形态特征,干细胞形态共性：细胞呈圆形或卵圆形，体积小，核质比大，增殖力强干细胞的固定组织位置：多数的干细胞有固定存在部位与方式,干细胞的生化特性,端粒酶活性高：如造血干细胞具癌细胞的端粒酶活性，增殖能力强。随着增殖与分化，端粒酶活性下降蛋白标志和免疫分子：不同干细胞有各异的蛋白质标志分子，可作为确定干细胞位置、分离提纯干细胞的标志。如：巢素蛋白神经干细胞；
4、角蛋白15表皮干细胞,干细胞有对称与不对称两种分裂方式,干细胞的分裂方式,干细胞的增殖特点,干细胞增殖速度较慢：小肠干细胞的分裂速度(Tc=11小时) 干细胞具有自稳定性：干细胞在个体生命过程中自我更新并维持其自身数目恒定 自稳定性是区别肿瘤细胞的本质特征,干细胞分化具有可塑性,干细胞的横向分化 在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为与其组织来源一致的细胞。但有时供体干细胞会分化出与其组织来源不一致的其它细胞，这种现象称干细胞横向分化(trans-differentiation)。实验：小鼠肌肉干细胞体外少量骨髓间质细胞培养5天接受致死量辐射的小鼠中各种血细胞系,横向分化的调控机制与干细
5、胞的微环境有关 干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应,启 示干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体中具有很强的可塑性临床上可寻找容易获得的其它组织干细胞，大量扩增后植入病变器官，在植入器官微环境诱导下向该系统细胞分化，这为干细胞治疗提供了可能,干细胞的逆向分化,干细胞的逆向分化（去分化） 一种干细胞向其前体细胞的逆向转化,干细胞增殖与分化的微环境,干细胞巢(stem cell nich，壁龛）： 干细胞在组织中的居所干细胞生存的微环境： 指干细胞巢中控制干细胞增殖与分化的外部信号,干细胞的微环境,常见的干细胞,胚胎干细胞
6、骨髓造血干细胞骨髓间充质干细胞神经干细胞表皮干细胞毛囊干细胞,干细胞应用研究重点,1细胞治疗干细胞可恢复因重大疾病而损害的细胞，这是干细胞潜在的最大优势,2基因治疗即通过胚胎干细胞和基因工程技术，矫正缺陷基因，将治疗基因整合到干细胞，再将干细胞移植入人体中，能够持久地发挥作用。肺囊性纤维化病是一种基因缺陷遗传病，30岁以前致死。若在胚胎早期干细胞中将缺陷基因修正，再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中， 将会生出一个健康的婴儿支气管肺发育不良,3、癌症治疗设计多种方法，使特定细胞能击中特定癌细胞，直接破坏或改变癌细胞。,4、器官移植 目前科学家已能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病变
7、或衰老的组织器官 有一天，真的会长生不老!,干细胞与肺部疾病的当前研究进展,小鼠胚胎干细胞可转化为肺细胞,小鼠胚胎干细胞在含有型胶原的培养基中可以分化成无纤毛的分泌细胞Clara 细胞 在含有小气道生成因子的无血清培养基中,小鼠胚胎干细胞可以分化成型肺泡上皮细胞,Coraux C , Nawrocki2Raby B , HinnraskyJ , et al . Embryonic stem cells generate airway epit helial tissue. Am J Respir Cell Mol Biol ,2005 ,32 (2) 87-92.,研究表明骨髓干细胞可以分化为
8、肺细胞,1 Krause 等将雄鼠的骨髓干细胞注入经放射线照射后的雌鼠体内, 在雌鼠体内20%的肺泡型细胞以及不到4%的气管上皮细胞为Y染色体2 Suratt等在一组同龄女性异体造血干细胞移植中发现,约2. 5% 8.5 % 的肺上皮细胞和37. 5% 42. 3%的肺内皮细胞是男性供体来源,1 Krause D S, Theise N D, CollectorM I, et al. Multi2organ,multi-ineage engraftment by a single bone arrow derived stem cell.Cell, 2001, 105: 3693772 Sur
9、att B, Cool C, Serls A, et al. Hunlgn pulmonary chimerism after hematopoietic stem cell transp lantation. Am J Resp ir Crit CareMed, 2003, 168: 3 l8322,肺干细胞,Uhal B等多数研究认为基底细胞是大气道内的固有干细胞，clara细胞是细支气管内的固有干细胞群 ，肺泡型细胞是肺泡细胞的干细胞Delp lanque等将一个21 周胎儿的气管切成圆形薄片植入SCID小鼠皮下, 可以见到正常人气道黏膜的各种细胞演化，Delp lanque等认为这是气
10、道局部成体干细胞分化的结果。所有的肺干细胞生长更新率极低和再生能力非常有限,现有动物实验表明干细胞能治疗的肺疾病,当前国外研究干细胞与肺疾病的方向,干细胞治疗肺疾病的思考,干细胞治疗肺疾病具有现实意义,COPD、肺纤维化、矽肺、肺动脉高压、结核性肺毁损发病率高，危害大，但目前尚无特效的治疗手段现有的动物实验证明：干细胞在肺中可产生细胞因子，分化成新的肺泡，重建新的气道，形成新的血管，好比为病人提供了新的肺叶，对这些疾病的治疗将是一种革命性的变化干细胞技术相对成熟，在心肌梗塞、帕金森氏症、糖尿病方面已提供了可成功借鉴的经验干细胞研究是当前乃至今后相当长时间的热门领域，可以预见谁掌握了干细胞谁将在
11、学术和效益方面取得成功,干细胞移植的技术路线,细胞的选择,胚胎干细胞：较难得到，数量有限，需大量扩增，必须体外诱导定向分化，异体移植存在免疫排斥骨髓干细胞：来源广，容易获取及扩增，不必须体外诱导定向分化，自体移植，不存在免疫排斥问题肺干细胞：只能取材于病人呼吸道和肺组织，传代扩增能力差我的思考：从骨髓中获取干细胞可能是最现实的选择,细胞分离,骨髓干细胞可能含有三个细胞群造血干细胞间充质干细胞内皮细胞前体细胞多数动物实验利用骨髓间充质干细胞治疗肺病，也有实验进行全骨髓移植我的想法：全骨髓，更易操作，含有内皮细胞前体细胞或许有助于形成血管我的思考：1、采用全骨髓时，造血干细胞对COPD是否会导致红
12、细胞增多症加重？ 2、治疗肺部疾病全骨髓疗效是否更好？,传代扩增,骨髓间充质干细胞数量少，占骨髓细胞数的1/10万若不进行有效的扩增，将分离的干细胞直接输入体内，相对整个肺来讲，犹如苍海一粟，少量的供体细胞难以产生效应我的顾虑：若体外扩增，非常繁锁，最终要回输人体，实验条件及安全性难以符合要求我的想法：抽吸更多骨髓，获得更多干细胞不行体外扩增，直接回输人体可能是条捷径,细胞表型鉴定,利用免疫沉淀印迹技术、免疫磁珠技术和流式细胞技术可进行标记物测定骨髓间充质干细胞可测粘附分子ICAM-1，CD49等肺干细胞sca-1、表面分子、细胞角蛋白、CCSP等我的无耐：行细胞表型鉴定，技术要求及费用高，不
13、做实验缺乏可信度,干细胞注入机体的途径,尾静脉和腹腔注射：是当前“干细胞治疗肺疾病”动物实验中最常用的方式。陈旧性心梗、帕金森氏病多采用病灶处局部注射的方式。脑瘫可采用腰穿注射。肝硬化采用肝固有动脉局部灌注。我的思考：1、局部注射？静脉点滴？气管内给药？哪种方式效果最佳？2、我们能否借助介入技术行支气管动脉超选择性叶段注入？,如何保证干细胞由血管内进入病灶定居,实验表明：通过静脉输注骨髓干细胞，只有极少部分到达了肺，绝大多数又归巢到骨髓如何保证循环中足够数量的干细胞由血管内进入肺部病灶定居分化是影响疗效的关键因素我的思考：1、能否利用某些病毒载体转染干细胞，使干细胞表面具有特殊的受体增强对肺组
14、织的亲合力？,干细胞在肺组织内的定向分化,实验表明：干细胞的分化受局部微环境的影响，进入肺组织中的干细胞有向40多种肺组织细胞自主分化的潜能我们的任务是只要把足够量的干细胞送入肺组织，而不需要体外实验那样去研究加入何种因子去诱导,疗效的检测,动物实验中疗效的检测：可将动物处死，检测肺组织的结构变化和干细胞标记物在临床实验中如何进行疗效的评定？我的思考：血气、肺功能、HRCT及PET影像、TNF因子及金属蛋白酶等含量的变化可做探索性研究,有实验表明：干细胞的分化方向与组织损伤的时间有关，在损伤急性期向肺泡等组织细胞分化，但在慢性期向成纤维细胞转化可加重肺纤维化干细胞治疗肺疾病到底有没有效？,我们的路线选择,学术路线干细胞治疗肺疾病是一个充满希望的领域，在省内尚无人问津，借助我院省级重点实验室-胚胎干细胞和生命科学研究所平台争取获得省市级科研立项2-3个，寻找资金支持。按照各个技术环节实施，比较严谨，可以增强科室的科研总体实力行成可持续发展的后劲，并为今后的临床研究积累更多的经验。,干细胞移植的临床路线,挑战：疗效充满未知，费用高昂，缺乏严密的评估体系，不易得到公认机遇：有用就是道理，可提高科室影响力,2000元,试剂盒/个10000/15000元,9000元,2000元,人民医院呼吸科,谢 谢!,
