1、临床微生物学概论（第一部分）,复旦大学附属华山医院抗生素研究所,2,标本采集细菌的分离培养和鉴定抗菌药物敏感性试验,主要内容,3,正常菌群,在正常人体体表与外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、肠道、泌尿生殖道存在的多种微生物。在机体免疫功能正常时对人体有益无害，属人类正常微生物群或环境中通常不致病的微生物，因以细菌和真菌为主，故称“正常菌群”。正常菌群的存在是保持人体健康的重要因素反映出在正常情况下，宿主、正常菌群和外界环境相互适应，保持平衡状态。,4,5,病原微生物,病原微生物(pathogen)： 引起人类感染性疾病的微生物称为病原微生物或致病微生物。细菌：如痢疾志贺菌、肠杆菌科细菌、金黄色葡萄
2、球菌、肠球菌属等病毒：如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒等真菌：如念珠菌属、曲霉属、毛霉属以及新型隐球菌等其他：如支原体、衣原体、螺旋体,6,临床常见的病原微生物,革兰阳性菌：葡萄球菌、溶血性链球菌、肠球菌革兰阴性菌：需氧球菌： 脑膜炎和淋病奈瑟球菌、卡他莫拉菌需氧杆菌： 不动杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、嗜血杆菌需氧和兼性厌氧：肠杆菌科细菌如大肠杆菌、肺杆、伤寒、志贺菌。厌氧细菌：脆弱拟杆菌、痤疮丙酸杆菌等,7,苛 养 菌,定义：是一类生长需要特殊营养物质的细菌，与许多感染性疾病有关，其分离培养较为困难。营养要求高肺炎链球菌：培养基内要加入血或血清流感嗜血杆菌：X、V因子比较娇嫩、对干燥、
3、对寒冷的抵抗力均较弱。培养条件：510CO2、35培养、24 48h呼吸道其他快生长细菌的覆盖使分离率非常低,8,厌 氧 菌,是一群专性厌氧，必须在无氧环境下才能生长繁殖的细菌。根据能否形成芽胞，可将厌氧菌分成两大类。厌氧芽胞梭菌属无芽胞厌氧菌厌氧芽胞梭菌属：破伤风梭菌、产气荚膜杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌无芽胞厌氧菌：拟杆菌属、梭杆菌属、丙酸杆菌属、消化链球菌属等,9,标本的采集,抗菌药使用前正确的部位正确的时间足够的数量无菌的容器特殊要求应在化验单上注明,10,主要的临床标本种类,标本类型呼吸道标本深部咳出痰、支气管灌洗液咽拭子、鼻气管吸出液、气管吸出液尿液 血液 脑脊液伤口、脓液其它体液胸水
4、、心包液、引流液、腹水、滑囊液,11,标本的处理,涂片光镜检查诊断病原最基本和快速的方法：脑脊液直接形态学检查革兰染色或特殊染色分离培养和鉴定动物接种免疫学检查,12,痰标本主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌,病人需用水清洁口腔，深咳肺部痰，不要唾液,#1,进行革兰染色以评价标本是否适于接种。向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果,#2,#3,好：很少扁平上皮细胞,奥普托欣纸片,CO2中孵育48小时,#4,接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿,#5,拒绝：大量 扁平上皮细胞,肺炎克雷伯菌,对重要病原菌进
5、行鉴定&药敏试验,金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,胆汁溶菌,奥普托欣,流感嗜血杆菌,13,革兰染色评估呼吸道标本是否合格？,有代表性的好标本中性粒细胞多白细胞25/低倍视野鳞状上皮细胞少 10/低倍视野,14,痰标本10鳞状上皮细胞/每低倍视野=拒收,19,#1,b,a,b,尿培养主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金葡球菌,#2,接种血平皿和麦康凯平皿,#3,空气孵育24小时,收集中段尿,a,#4,菌落计数,0.001ml接种环,若 2 种菌生长，对每种菌进行鉴定和药敏试验；若2种菌生长，报告“混合菌群”,#5,注意:,革兰阴性杆菌在血平皿和麦
6、 康凯平皿上均生长良好革兰阳性球菌仅在血平皿上生长良好,GNR,#6,75,000 cfu/ml,50,000 cfu/ml,100,000 cfu/ml,GPC,20,脓，吸取物或组织标本主要病原菌：金葡菌，化脓链球菌，其他溶血链球菌，绿脓，其他革兰阴性杆菌。非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌,用酒精消毒伤口周围皮肤最好的标本是吸取物和组织最差的标本是拭子,#1,接种血平皿和麦康凯平皿如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通知临床医生,#2,#3,铜绿假单胞菌,中孵育48小时,#4,对1或2种重要病原菌进行鉴定&药敏试验,金黄色葡萄球菌为主,溶血链球菌,肺炎克雷伯菌,
7、混合的2种肠道革兰阴性杆菌：2种均报告；,当检出3种或更多病原菌时，报告“混合菌丛”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。,#5,21,血培养主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金葡菌、肺链、流感以下菌应视为非病原菌(除非1次血培养分离出)： 芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌,从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集10ml,#1,35 自动化仪器中孵育5天每天检查浊度并翻转培养瓶,#2,#3,18小时后传进行次代培养当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养,革兰阳性球菌接种血平皿奥普托欣试验,革兰阴性杆菌接种血平皿和麦康凯平皿,革
8、兰阴性双球菌或球杆菌接种巧克力平皿和血平皿,CO2中孵育72h,#5,#4,将重要的革兰染色结果尽快通知临床医生,对重要病原菌进行鉴定和药敏试验,#6,例如：肺炎克雷伯菌,例如：肺炎链球菌,22,细菌的分离培养,23,细菌的分离培养,按实验室常规接种于培养基培养条件：35 24-48小时或5%-10% CO2 35 24 - 48小时厌氧培养,28,具有特殊性状的细菌,葡萄球菌,铜绿假单胞菌,溶血性链球菌,29,具有特殊性状的细菌,矛头状,自溶现象,芽胞,30,细菌的鉴定,表型分类法以细菌的形态、结构、生理、生化和血清学反应等细菌的表型为主要依据分子生物学技术基因诊断依据分析DNA的碱基组成，
9、基因片段的大小，与比较DNA的同源性关系，从而分析 细菌DNA的亲缘关系。,31,流感嗜血杆菌的卫星现象,32,菌种鉴定鉴定到种,根据纯分细菌的形态、菌落特征，特征性的生化反应，选择合适的细菌鉴定系统。如手工的API条和半自动的ATB肠杆菌科细菌：API 20E非发酵革兰阴性杆菌：API 20NE葡萄球菌属：Slidex Staph Plus、API Staph链球菌属：Slidex Strepto Kit、API Strep奈瑟菌属、嗜血杆菌属：API NH厌氧菌：API 20A,33,菌种鉴定鉴定到种,自动细菌鉴定/药敏仪VITEK 2 CompactBD Phoenix System M
10、icroScanBIOMIC V3微生物鉴定系统BIOFOSUN微生物鉴定系统鉴定到种葡萄球菌？金黄色葡萄球菌！,细菌鉴定和药敏试验快速化是未来的趋势,张嵘教授课件内容,张嵘教授课件内容,张嵘教授课件内容,CTX-M-14（+）,生理盐水,头孢噻肟,CTX-M-14（-）,质谱检测黏菌素耐药鲍曼不动杆菌,Clinical Infectious Diseases 2015; 60(9):1295303,敏感株,耐药株,张嵘教授课件内容,39,抗菌药物敏感性试验,40,抗菌药物和药敏试验,抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物，后者是经化学改造的
11、半合成抗生素和化学合成药物。测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST），简称药敏试验。,41,抗菌药物敏感性试验的意义,无法推测敏感或耐药病人个体化治疗指南提供经验治疗的依据建立当地或国家处方政策监测流行病学趋势监测细菌耐药性测试新抗菌药物的抗菌活性 检测新耐药机制的方法,42,抗菌药物敏感性试验分类,定量方法 (MIC, mg/L)琼脂稀释法肉汤稀释法E-test定性方法 (SIR)纸片扩散法自动化仪器,稀释法的定义,以一定浓度的抗菌药与含有被试菌株的培养基进行一系列对倍数稀释
12、，经培养后肉眼观察未见细菌生长管内所含的最低药物浓度为该药对该试验菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)稀释法的最大优点是可以精确测得药物最低抑菌浓度，但需耗费较多材料、人力和时间。,稀释法的分类,稀释法药敏试验因介质不同可分为液体稀释法和琼脂稀释法。因容器不同分为试管稀释法和微量稀释法，或称常量法和微量。前者使用无菌的13mm100 mm试管，每一浓度抗菌药的量至少为1ml；后者使用812的U型底小孔的微量稀释板，小孔内装有0.1ml肉汤。琼脂稀释法又因在平皿中进行而称为平皿稀释法。微量稀释法的优点为试剂材料较节省，而且微量板中可预先配
13、制好抗菌药和培养基，冷藏后一定时期内使用，较为方便。与试管稀释法相比，琼脂稀释法配合多点接种器使用，可同时进行大量菌株的药敏试验，实验结果重复性好，缺点是不能进行最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration, MBC)的测定。,与稀释法药敏试验有关的指标有哪些？,MIC：最低抑菌浓度MBC：最低杀菌浓度MIC50：抑制50%受试菌株的MIC值MIC90：抑制90%受试菌株的MIC值MBC50：杀死50%受试菌株的MBC值MBC90：杀死90%受试菌株的MBC值,琼脂稀释法,琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多点接种器接种细菌
14、。经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度为最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC ）试验菌的结果报告可用MIC（ug/ml ）或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。,8,16,多点接种仪,试管稀释法,试管稀释法,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32,MIC1ug/ml,微量稀释法,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32,64,128,A,B,C,D,E,F,G,H,微量稀释法,微量稀释法结果阅读,E-试验,E试验原理,E试条（E-test）是一条 5mm50m
15、m的无孔试剂载体，一 面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物对细菌的最低抑菌浓度（MIC）,结果判断和报告,读取椭圆抑菌环与E试验试条的交界点刻度值,E-试验结果阅读,纸片扩散法,58,纸片扩散法原理,将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。,59,纸片扩散法结果图,60,规范化的
16、药敏试验方法-扩散法(纸片法),原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度（MIC）。,61,如何正确挑取细菌？,菌落？ 至少3个菌落，为什么？,可能丢失耐药细菌(携带有耐药质粒的耐药菌株) .,62,正确的接种菌量,扩散法：0.5麦氏浊度（1.5108CFU/ml）,Select colonies,Prepare inoculumsuspension,63,充分混匀,标准浊度,菌苔厚度的要求,Clin Microbiol Infect 2014; 20: O831
17、O839,J Antimicrob Chemother, 2010; 65: 249-251,接种菌量升高导致MIC升高,接种菌量升高导致改良Hodge试验假阳性升高,DMID,2004; 49: 41-46.,67,合适的培养基厚度,普通细菌MH琼脂培养基（MuellerHinton Agar）培养基厚度：4mm肺炎链球菌及其他链球菌5脱纤维羊血MH琼脂培养基嗜血杆菌属嗜血杆菌培养基（HTM）SR158添加剂,错误做法：采用血琼脂做肠球菌的药敏试验,68,4.合适的培养条件,需氧菌： 35 2 ，16-18小时嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时葡萄球菌：33-35 ，苯唑西林
18、、万古霉素 24小时肠球菌：万古霉素-24小时溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时,69,5.正确阅读结果（纸片法）,工具：游标卡尺，尺子光源：反射光、透射光阅读： 药敏平皿背衬不反光的黑色背景用肉眼观察也可用机器阅读抑菌圈直径抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略,70,正确测量苯唑西林、万古霉素和利奈唑胺对葡萄球菌；以及万古霉素对肠球菌的抑菌圈直径,透射光,反射光,70,不要用反射光,要使用透射光,抑菌圈内有菌落，怎么办？,大肠埃希菌污染有肠球菌菌落再次纯分,铜绿假单胞菌有耐药菌落,73,CLSI文件：我国部颁标准,74,结果判断和报告：纸片扩散法
19、 1株细菌1个药1个标准,用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。通常采用CLSI公布的药敏结果判断标准，采用三级划分制。临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI 是我国的部颁标准,肠杆菌科细菌判断标准,结果判断和报告：稀释法 1株细菌1个药1个标准,76,结果判断和报告,敏感（Susceptible）：当一种细菌引起的感染，用某种药物常规量治疗有效，这种细菌即对该药高度敏感。中度敏感（Intermediate）：当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药物时有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩的部位或体液（如尿、胆汁、肠
20、腔等）中时才被抑制，这种细菌对该药仅呈中度敏感。耐药（Resistance）：药物对某一细菌的药敏高于药物在血或体液内可能达到的浓度时，有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，仍应判定该菌为耐药。例如产青霉素酶的金葡菌即应认为该菌对青霉素耐药。,77,6.重要的质控菌,肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922非发酵菌： 铜绿假单胞菌ATCC27853葡萄球菌： 金黄色葡萄球菌ATCC25923肠球菌： 粪肠球菌ATCC29212肺炎链球菌： 肺炎链球菌ATCC49619嗜血杆菌： 流感嗜血杆菌ATCC49247,78,改变条件对于质控的要求,79,改变条件对于质控的要求,8
21、0,纸片法药敏试验结果异常分析,81,天然耐药,82,（二）正确的抗菌药物组合,原则：针对监测细菌设计监测药物的品种和数量CLSI抗菌药物选择的原则（A、B、C、U组）根据病原菌的种类革兰阳性球菌葡萄球菌、肠球菌 、链球菌等革兰阴性杆菌肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等根据本单位临床实际需要,83,FDA批准临床微生物室常规药敏试验分组,抗菌药：A .为常规的一级(一线)试验组合并常规报告结果B. 亦可用于一级(一线)试验，但应选择性报告，即当A组药物耐药时可以选择性地报告B组中的同类药物C. 为补充性药物，可选择性报告U. 为补充性药物,仅用于治疗尿路感染的选择用药,83,84,补充性药
22、物选择性报告的原则,对一线试验组合的药物耐药身体特殊部位患者不能接受一线试验组合的药物一线试验组合的药物对患者无效复数菌感染多部位感染,84,85,肠杆菌科细菌的抗菌药物选择,86,沙门菌属、志贺菌属细菌的抗菌药物选择,*肠道内沙门菌属和志贺菌属常规；*肠道外的沙门菌属加报 对于从粪便中分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试和报告氨苄西林，一种喹酮类药和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。此外对于胃肠外分离的沙门菌属还一定要测试并报告氯霉素及其某一种代头孢菌素的结果。 警告：氨基糖苷体外可能表现对沙门菌属和志贺菌属有活性，但临床却无效，故不应报它们为敏感。*16岁骨骼系统未发育完全的小儿应报头孢曲松的结果，不报环丙沙星和氯霉素的结果,87,葡萄球菌的抗菌药物选择,*报苯唑西林的结果,88,(三)监测菌种的要求,结核分枝杆菌、真菌和厌氧菌不列入耐药监测范围 需监测的临床分离菌必须鉴定到种葡萄球菌必须明确MRS：甲氧西林耐药MSS：甲氧西林敏感大肠埃希菌、克雷伯菌和奇异变形杆菌应明确是否产超广谱-内酰胺酶（ESBLs）？肺炎链球菌必须明确对青霉素的耐药属性PRSP：青霉素耐药PISP：青霉素中度敏感PSSP：青霉素敏感,Thank You！,
