1、荧光探针测定细胞内离子浓度技术,陶 亮中山医学院药理教研室,细胞内离子,cytoplasm,Na+,Cl-,Ca2+,K+,Fe2+,细胞内离子的生理功能,细胞结构的组成成分 血红蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中Cu2+维持细胞膜电位 K+、Cl-、Na+ 、Ca2+ 维持胞内外渗透压 Na+ 协同转运葡萄糖等营养物质排泄代谢产物,细胞内离子浓度异常与疾病,细胞内Ca2+异常与疾病,高血压,骨质疏松,癫痫,细胞内Na+异常与疾病,心律失常,猝死,细胞内K+异常与疾病,惊厥,阵发性舞蹈手足徐动症,细胞内离子浓度测定意义,预防疾病的发生 提高疾病诊断的准确性 增强治疗疗效,常用细胞内离子浓度测定方
2、法,常用测定方法,原子吸收光谱法 微量金属元素的测定：Na、K、 Ca2+化学滴定法 有机化合物与离子可产生颜色变化 如：Ca2+可使铬黑T由蓝变红，使钙盐指示剂 钙红从蓝变为酒红。放射性标记法放射性标记目标离子，如45Ca微电极法荧光探针法,其他新技术,核磁共振法NMR,不同脲素浓度下, 通过监测1H, 15N信号强度变化监控 MMP-12 折叠过程,其他新技术,生物芯片技术,荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度,Luis A. Rivas, et.al. A 200-Antibody Microarray Biochip for Environmental Monitoring: S
3、earching for Universal Microbial Biomarkers through Immunoprofiling,荧光探针,荧光：某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后，其原子中的电子被激发到较高的能级，从而产生吸收光谱，有些物质，当用紫外线照射时，它吸收了某种波长的光后还会发射处各种颜色和不同强度的光，而当紫外线停止照射后，这种光也随之消失，这种光称之为荧光。分类：自发性荧光：组织在短波长光照射下自行发射出的荧光，如组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光； 诱发荧光：组织与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出的荧光荧光探针：常用的诱发荧光，能产
4、生荧光的生物染色剂称之为荧光染料或荧光探针,荧光探针技术的应用,pH测定,Guoliang Ke,et.al. A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing,pH在6.0-8.0时，不同pH值，荧光探针具有不同荧光强度,细胞间通讯GJIC检测,标记活细胞线粒体,线粒体荧光探针,骨架蛋白,Merge,Abhik Mallick,et.al. Dual Drug Conjugated Nanoparticle for Simultaneous Targeting of Mitoc
5、hondria and Nucleus in Cancer Cells,DNA标记,通过XRay检测口服有机硅修饰PI荧光探针的口服吸收过程,Michihiro Nakamura, et.al.Thiol-Organosilica Particles Internally Functionalized with Propidium Iodide as a Multicolor Fluorescence and Xray Computed Tomography Probe and Application for Non-Invasive Functional Gastrointestinal T
6、ract Imaging,细胞膜电位检测,Jihoon Kim,et.al. Rapid Cytotoxicity Screening Platform for Amyloid Inhibitors Using a Membrane-Potential Sensitive Fluorescent Probe,细胞凋亡时，膜电位改变，膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度,荧光探针技术测定过程,荧光探针的负载荧光探针与目的离子结合荧光强度检测：荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计,荧光探针应用条件,负载：探针必须局限于要测定离子浓度的区域，最常见 的部位是细胞液，但有时为线粒体；校准：探针的荧
7、光强度必须与游离离子浓度定量相关,荧光探针的负载,大量负载：AM酯负载酸负载ATP诱导渗透阳离子脂质体递送电穿孔低渗休克单细胞负载 显微注射法膜片钳技术微量电泳法压力注射法,荧光探针的负载 AM酯负载,AM负载技术：Ca2+及其它阳离子探针的羧基和PH探针的酚 羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯，使探针可透过细胞膜并对离子不敏感，一旦进入细胞内，这些衍生的探针就可被普遍存在的细胞内酯酶水解，释放出离子敏感的多阴离子探针不足：区室化：细胞内膜包结构聚集AM酯不完全水解渗漏：有机离子载体、P糖蛋白多药载体等排除胞外,荧光探针的负载 AM酯负载,离解常数Kd：将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数校准
8、过程：记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号，通过换算计算出解离常数Kd，,荧光探针的校准,荧光探针技术检测Ca2+,Ca2+荧光探针分类,紫外光激发的荧光Ca2+探针可见光激发的荧光Ca2+探针荧光Ca2+探针交联物生物性发光Ca2+探针,紫外光激发的荧光Ca2+探针,高亲和力的钙探针：Fura-2, Indo-1及其衍生物 Fura-2成像显微镜首选 Indo-1流式细胞术首选中等亲和力的钙探针： Fura-4F、Fura-5F、Fura-6F、Fura-FF、Indo-5F低亲和力的钙探针： BTCBTC-AM，Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1金鸡纳皮素（
9、Quin）-2和Quin-2 AM 吸收率和量子产率比低，主要用来耗竭胞质液中游离Ca2+，确保单向性Ca2+内流,可见光激发的荧光Ca2+探针,高亲和力的钙探针： Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2和相关的衍生物基于Fluo-3和Rhod-2的低亲和力的钙探针： Fluo-5F、Fluo-4FF、Fluo-5N、Mag-Fluo-4、Rhod-5N钙绿Calcium Green、钙橙Calcium Orange、钙深红Calcium Crimson探针Fura Red探针钙黄绿素Calcein,荧光Ca2+探针交联物,葡聚糖交联物：Fura、Fluo-4和Indo葡聚糖水溶性，低毒性，
10、无生物活性抵抗内源性糖苷酶的裂解极少区室化很好的存在于活细胞内亲脂性衍生物：Fura-C18、Fura-FF-C18和钙绿-C18与膜表面结合，检测局部浓度变化,生物性发光Ca2+探针,水母素、重组水母素及其衍生物从发光的水母和其他海洋生物中分离得到的发光蛋白优点：可排除自发荧光的干扰不渗出，不分泌不发生区室化或细胞内隔离检测长期间内Ca2+变化,Fluo-4荧光探针检测Ca2+,Bright-Field,Fluo-4 fluorescence,Merge,Chenye Yang,et.al. Continuous Fluorescence Imaging of Intracellular C
11、alcium by Use of Ion-Selective Nanospheres with Adjustable Spectra,荧光探针技术检测Na+、K+及其它离子,荧光探针技术检测Na+和K+,SBFI和PBFI及其AM酯：苯并呋喃基荧光团连接到一种冠醚 螯合剂SBFI：对Na+选择性强PBFI：对K+选择性强 SBFI和PBFI的应用： SBPI用于测定分离线粒体的Na+梯度或不同组织和细胞内Na+水平或Na+外流 PBFI用于测定K+外流与细胞凋亡间关系,荧光探针技术检测Na+,钠绿比SBFI对Na+的选择性更高激发波长488nm，可替代Confocal和流式细胞仪进行检测对细胞
12、光损伤小应用：评估大鼠丘脑神经元持续Na+蓄积检测缺氧诱导的神经元Na+内流,荧光探针技术检测Na+,CoroNa RedCoroNa Red氯化物细胞通透性酯对Na+高选择性应用：对细胞的Na+内流产生敏感反应测定培养的上皮细胞和人肺组织气管气道表面液体,SBFI荧光探针技术检测Na+,Christophe M. Lamy,et.al. Sodium Sensing in Neurons with a Dendrimer-Based Nanoprobe,Control,TTX,TTX阻断Na+通道，Na+荧光探针标记Na+，膜Na+电位紊乱,荧光探针技术检测其它离子,荧光Cl探针：6-甲氧基
13、喹啉衍生物SPQ检测原理：经扩散限制的碰撞淬灭应用：用于检测CFTR活性其他转运蛋白，如GABAA、红细胞ClHCO3交换器等荧光探针技术检测其他离子氰化物硫化物、亚硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根亚硝酸根、硝酸跟和一氧化氮磷酸根和焦磷酸根硒,荧光探针技术检测pH,荧光探针技术检测pH,细胞内胞质液pH常为6.87.4，而酸性细胞器内pH则为4.56.0细胞内pH值可部分发生改变，而且速度相当慢荧光pH探针可有效检测不同生理和病理过程中pH变化生理范围的pH测定SNARF、SNAFL酸性细胞器的pH测定LysoSensor探针,用于测定近中性pH的荧光探针,荧光素黄 中性pH测定首选发射波长较长、量
14、子产率高 易从细胞内流失荧光素黄衍生物BCECF 2,7-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素不易透过细胞膜pKa=6.98,更适于生理条件下pH的测定SNAFLs半萘酚荧光素类 pKa在7.67.9范围内均发生漂移,可用比率法测定体系的p H 值,SNAFLs半萘酚荧光素类,共轭程度更大, 其吸收波长也更长,酸性pH使用的探针,LysoSensor探针与生物大分子共价结合，通过细胞固有机制主动摄取检测酸性细胞器，追踪酸性细胞器运输俄勒冈绿和二氯荧光黄衍生物,荧光探针技术检测pH,不同pH条件下，荧光探针CN-pH荧光强度不同，测定荧光强度可计算出相应的pH值,Baoli Dong,et.a
15、l. Dual Site-Controlled and Lysosome-Targeted Intramolecular Charge TransferPhotoinduced Electron TransferFluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescent Probe for Monitoring pH Changes in Living Cells,荧光探针强度检测方法的选择,激光共聚焦显微镜 流式细胞仪 双波长荧光光度计,激光共聚焦显微镜（LSCM）,LSCM探针选择,荧光探针与研究的结构有密切关系选择荧光强度较强的探针同时应用多种荧
16、光探针时，避免发射光谱重叠荧光探针溶剂对荧光强度无影响如组织需固定，选择耐受固定剂的荧光探针,荧光信号的检测,Gm促进Rhod2标记的Ca2+向胞浆转移,Edgar J. Paredes-Gamero,et.al. Cell Permeable Gomesin Peptide Promotes Cell Death by Intracellular Ca2+ Overload,流式细胞仪,荧光探针的选择,荧光信号检测,Wan-Kyu Oh ,et.al. Fluorescent Polymer Nanoparticle for Selective Sensing of Intracellula
17、r Hydrogen Peroxide,检测FITC-PAN标记的H2O2的释放量,双波长荧光光度法,双波长荧光光度法,应用条件： a) 干扰组分在该两波长处的吸光度相同 b) 被测组分在该两波长的吸光度差A要足够大,双波长荧光光度法测定Ca2+,原理：,荧光探针： 第一代：quin-2 第二代：Fura-2 用于双波长荧光示踪测定Ca2+i 第三代：Fluo-3 用于激光光聚焦显微镜测定Ca2+i,Fura-2有二种形式,Fura-2 游离形式，不能透过细胞膜，可与Ca2+结合； 激发峰值: 380nm，与Ca2+结合后 340nm,Fura-2/AM 酯化形式，可以透过细胞膜， 不能与Ca
18、2+ 结合,Fura-2/AM 进入细胞,水解形成Fura-2,Fura-2 - Ca2+,+ Ca2+,激发峰值 380nm,340nm,酯酶,Ca2+i = Kd (FFmin) / (FmaxF) Kd: Fura-2与Ca2+反应的解离常数，生理条件下= 224nmol/L F: 实验记录到的荧光比值（F340/F380）Fmax ：最大荧光值：加Ca2+载体将细胞外Ca2+载入细胞测得Fmin ：最小荧光值：加螯合剂使Ca2+i为“0”时测得,结果计算：,双波长荧光光度法测定Ca2+,制备细胞悬液Fura-2负载：加入溶于DMSO的Fura-2AM，37摄氏度恒温振荡30-45min，负载后的细胞以含0.2%BSA的Hanks液洗2次。双波长荧光光度计测定：测定条件激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，以300-420nm扫描激发光谱。如峰值在340nm，表明Fura-2已负载入细胞内，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同实验条件下荧光强度的变化,总 结,根据检测目的离子，选择特异性荧光探针；根据所选择荧光探针，选择相应的检测方法；提高荧光探针的负载率；,谢 谢！,
