1、本科毕业设计环境工程厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究THEVARIATIONOFMICROBEANDENZYMEACTIVITYDURINGAEROBICCOMPOSTINGOFKITCHENGARBAGE厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究I厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究摘要通过分别测定不加水葫芦（批样1）和加水葫芦（批样2）的厨余垃圾堆体的温度、含水率、PH值、TOC、TN、垃圾中的有机质、微生物、蛋白酶活性、脲酶活性、过氧化氢酶活性来研究好氧堆肥过程微生物和酶活性变化规律。实验结果表明，垃圾堆体的温度最高分别可以达到44和65，太阳能加热和电
2、加热系统相结合能对堆体供热更稳定。垃圾堆体的含水率、TOC、有机质含量均下降。堆体中微生物细菌占主导地位，微生物菌落数均呈先增多后减少的趋势；蛋白酶活性在堆肥后期变大，说明蛋白质的降解主要在堆肥后期；脲酶活性整体呈下降趋势，由最初的269MG和138MG分别下降至003MG和094MG；过氧化氢酶活性在整个过程中比较稳定，有机质的降解强度比较稳定。关键词厨余垃圾；好氧堆肥；微生物；酶活性THEVARIATIONOFMICROBEANDENZYMEACTIVITYDURINGAEROBICCOMPOSTINGOFKITCHENGARBAGEABSTRACTBYMEASURINGPARAMETER
3、SOFKITCHENGARBAGEWITHEICHHORNIACRASSIPESANDWITHOUTITSUCHASTEMPERATURE,MOISTURECONTENT,PH,TOC,TN,ORGANICMATTERCONTENT,MICROBE,PROTEASEACTIVITY,UREASEACTIVITY,CATALASEACTIVITYTOSTUDYTHEVARIATIONOFMICROBEANDENZYMEACTIVITYDURINGAEROBICCOMPOSTINGTHERESULTSSHOWTHAT,THEHIGHESTTEMPERATUREOFTHEGARBAGEIS44AND
4、65,SOTHESOLARHEATINGCOMBINEDWITHELECTRICALHEATINGCANKEEPTHETEMPERATUREOFTHEGARBAGEMORESTABILITYTHEDATAOFMOISTURE,TOC,ORGANICMATTERCONTENTHAVEADECLINEBACTERIALCOLONIESISTHEMOSTINALLMICROORGANISMSATTHEBEGINNINGOFTHECOMPOSTING,MICROBECOLONIESINCREASEANDLATERREDUCEPROTEASEACTIVITYINCREASESINTHELASTDAYS,
5、THEREFORETHEDEGRADATIONOFTHEPROTEINISMAINLYINTHELASTDAYSUREASEACTIVITYSHOWSDOWNTRENDINTHECOMPOSTING,FROM269MGAND138MGTO003MGAND094MGCATALASEACTIVITYISSTABILITYDURINGTHECOMPOSTING,ASARESULTTHEORGANICMATTERDEGRADATIONISSTABLEKEYWORDSKITCHENGARBAGEAEROBICCOMPOSTINGMICROBEENZYMEACTIVITY厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活
6、性变化规律研究II目录1引言111厨余垃圾1111厨余垃圾的定义1112厨余垃圾的特性及处理方法112堆肥技术1121堆肥化的定义1122堆肥化分类2123高温好氧堆肥处理优点213堆肥主要控制参数2131温度2132PH2133含水率2134TOC和TN3135有机质314堆肥过程微生物及酶的作用3141微生物降解有机质的机理3142酶的性质和作用32材料与方法421实验材料422实验装置423各参数测定方法5231温度的测定5232含水率的测定5233PH的测定5234TOC的测定6235TN的测定7236有机质的测定9237微生物的测定9238蛋白酶活性的测定12239脲酶活性的测定13
7、2310过氧化氢酶活性的测定1424实验技术路线153结果与讨论1531温度1532含水率1633PH1734TOC1835TN1836有机质1937微生物2038蛋白酶活性2139脲酶活性22厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究III310过氧化氢酶活性224结论与建议2341结论2342建议245展望246参考文献257致谢错误未定义书签。厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究11引言随着经济的快速发展和人们生活水平的逐渐提高，生活垃圾的产生量与日俱增。目前，固体废弃物的年平均增长速度已是经济增长速度的23倍1。城市垃圾污染已成为制约各国经济发展，危害城乡居民健康的一
8、个不可忽视的问题2。因此，对城市生活垃圾的科学处理已成为各级政府不可忽视的重要课题。陈礼勇通过调查分析认为多位一体综合处理是城市生活垃圾末端消纳的最佳途径，即对混合垃圾进行分检，然后对不同垃圾成分，采用不同的处理方式，即无机物填埋、可燃物焚烧、易腐有机物进行堆肥化处理3。世界各国根据各自的国情，分别采用填埋、焚烧、生物降解法包括堆肥化等技术处置固体废弃物。但由于填埋需占用大面积土地，渗滤液含有毒物难以处理，焚烧技术投资成本高又易对环境造成二次污染等原因，使得填埋与焚烧技术的应用受到限制。好氧堆肥发酵法在经历了一段兴衰演变后，近年来又出现了蓬勃发展的势头1。厨余垃圾是生活垃圾的主要组成部分，因此
9、，厨余垃圾的处理成为了广泛关注的课题。11厨余垃圾111厨余垃圾的定义餐厨垃圾主要是指家庭、饭店、食堂等产生的食物废料和残羹剩饭4。厨余垃圾是有机垃圾的一种，包括剩菜、剩饭、菜叶、果皮、蛋壳、茶渣、骨、贝壳等，泛指家庭生活饮食中所需用的来源生料及成品（熟食）或残留物。112厨余垃圾的特性及处理方法厨余垃圾容易变质、腐烂，滋生病菌，造成疾病的传播，散发的恶臭气体污染大气，影响人的视觉、味觉以及生活卫生条件，并且容易产生渗滤液污染地表水和地下水。厨余垃圾是人们在生活消费过程中形成的废弃物，其有机质含量丰富，含水率高，在收集和运输过程中易腐烂，会降低垃圾储存、输送、破碎和分离效率，高含水率，高有机质
10、含量的特性不利于其进行填埋或焚烧处理。厨余垃圾的处理方法包括高温好氧堆肥、厌氧发酵、蚯蚓处理、干燥热处理和湿热处理等，这些处理方法中，堆肥处理和湿热处理是目前两种代表性资源化处理技术，早已实现规模化处理技术5。采用高温好氧堆肥方法可实现厨余垃圾的无害化、减量化、资源化6。12堆肥技术121堆肥化的定义堆肥化处理是指依靠自然界广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，对有机物有控制的进行厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究2生物降解，使之转化为腐殖质的生物化学处理技术7。城市垃圾好氧堆肥是指在有氧的情况下垃圾中有机物的氧化分解，使之生物代谢成为二氧化碳和水，释放出能量的同时使垃圾中的不稳
11、定有害物质得以分解，病原菌体在高温堆层中致死，垃圾的含水率降低，原垃圾的体积与重量减少，从而使堆肥产品达到无害化标准。122堆肥化分类固体废物堆肥分为好氧堆肥和厌氧堆肥。好氧堆肥是在有氧条件下，好氧菌对废物进行吸收、氧化、分解。微生物通过自身的生命活动，把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物，同时释放出可供微生物生长活动所需的能量，而另一部分有机物则被合成新的细胞质，使微生物不断生长繁殖，产生出更多生物体的过程8。厌氧堆肥是在缺氧条件下，主要由厌氧类和兼氧性微生物分解易腐有机物。123高温好氧堆肥处理优点好氧堆肥是利用好氧微生物在人工控制条件下将有机物降解为稳定的腐殖质的过程，是一种重要的固
12、体废物生物处理技术9。好氧堆肥反应器系统具有堆体温度高、发酵时间短、有机物分解彻底、有效防止病原菌的传播和异味散发的优点10。13堆肥主要控制参数131温度物料温度是决定微生物种群优势的主要因素，有机物降解速度关键是取决于高温分解菌的数量，有机垃圾堆体温度控制在5060之间，既保持较高数量的高温分解菌，有利于有机物的快速分解，又有利于去除病原菌微生物实现卫生无害化，是较为合适温度条件3。132PH微生物的生长受到PH的影响，高于或低于最适生长条件，都会抑制微生物的活动11。在堆腐垃圾时，PH值控制在8左右可以显著提高堆肥初期的反应速度，可以极大地缩短堆肥达到高温所要求的时间，可以避免由于堆肥反
13、应延缓所造成的臭味问题。有机废物发酵过程适宜的PH值为657512。133含水率在堆肥过程中，由于微生物只能摄取生命活动必须的溶解性养料，所以水分含量是好氧堆肥的关键因素。水分的多少应保证微生物的生化反应能以合适的速率稳定的进行，水分过高会引起堆层中空隙厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究3减少，氧气交换降低，微生物的活性降低。使堆肥的温度迅速达到有效温度，起始含水率是非常关键的。建议通常为5055为最佳起始含水率13。134TOC和TN堆肥过程中碳源、氮源是微生物直接用来合成自身生命体的重要组成部分，有机物料中起始有效态碳、氮物质及分解过程中产生的碳、氮强烈地影响整个堆体的分解过
14、程和氮的生物固定。碳在微生物新陈代谢过程中约有三分之二变成二氧化碳而被消耗掉，三分之一用于细胞质的合成，所以一部分碳被称为细菌的能源，而氮主要用于细胞原生质的合成14。135有机质在堆肥过程发生的各种生化反应中，有机质是微生物赖以生存和繁殖的基本条件，因此有机质的变化能在一定程度上反映出堆肥的进程，许多学者通过研究堆肥过程中有机质的降解率来判断堆肥的腐熟度15。14堆肥过程微生物及酶的作用141微生物降解有机质的机理堆肥是通过微生物细菌、放线菌和真菌的协同作用，将复杂的有机物降解为细胞可以吸收利用的小分子物质及腐殖质作为最终产品，并释放二氧化碳和能量、热3。微生物分解有机物的能力取决于它们所产
15、生分解有机物酶的能力。底物越复杂，所需要的酶系统越广泛并具有综合性16。好氧堆肥处理是依靠垃圾中各类微生物细菌、真菌和放线菌在分解有机物的过程中交替出现，使堆温上升、下降，从分解水溶性有机物开始，逐渐分解难降解有机物如纤维素和木质素，并转化为腐殖质17。厨余垃圾好氧堆肥过程是在微生物及其分泌的酶作用下进行的。整个堆肥进程中，中期微生物量达到最大，随后微生物量降低，这是由于堆肥后期有机物基本降解完，营养物质的缺乏导致微生物的死亡。随着可利用碳源的减少，堆肥后期微生物量递减并趋于稳定，其终值略高于堆肥初期18。142酶的性质和作用堆肥过程的本质是在微生物分泌酶的作用下，把有机物降解并进一步转化成腐
16、殖质的生物化学过程，整个生物化学过程都是在酶参与下进行的酶促反应。酶具有高度专一性、多样性和催化的高效性。根据酶的活动部位，可将酶分为胞外酶和胞内酶。胞内酶是在细胞内起催化作用的酶在这一过程中，胞内酶种类较多。胞外酶是由微生物细胞产生并分泌到细胞外面进行催化活动的酶，通常催化聚合物质的降解，如植物聚合物、纤维素、木质素等，使这些分解后的小分子物质穿透细胞质膜，实现降解19。在堆腐矿质化过程中，主要为水解酶类起作用，包括纤维素酶、蔗糖酶、脲酶等。厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究4在堆腐腐殖化过程中，主要为氧化还原酶类起作用，包括过氧化氢酶、脱氢酶、多酚氧化酶等。2材料与方法21实
17、验材料本实验材料从宁波大学某餐厅采集，放于实验装置中堆肥。本论文对两批样进行了分析研究，批样一为纯厨余垃圾；批样2为厨余垃圾与风干碎化后的凤眼莲（俗称水葫芦）按21比例混合后形成的样。批样二加水葫芦是为了调节垃圾的含水率，与批样一形成对照。实验材料的初始性质见表21。表21实验材料的初始性质批样含水率PHBDMTNTPTOCC/N批样186533482517602551852942批样260857141252230234502201622实验装置本次实验堆肥所用装置为卧式螺旋搅拌太阳能好氧堆肥器。实验堆肥工艺是间歇式好氧动态堆肥，即采用每天进料和每天出料的方式，堆肥原料在发酵装置内完成中温和高
18、温发酵过程后出料；此系统中的物料处于一种间歇式翻动的动态情况下。具体来说，物料每天从进料口进料一次，每次30KG，进料的同时开动螺旋搅拌装置，物料沿螺纹方向呈推流式向前流动，轴每转动一圈，物料向前推进一个螺距。螺旋搅拌由电机驱动，通过减速器控制速度。经减速后，螺旋结构约10MIN旋转一周。实验装置设有通风供气系统，实验通风方式属于周边布气。通风供气系统包括气流缓冲腔，发酵仓周边开设的通风孔和风机。结合堆体温度及堆体含氧量情况，选定通风量和通风频率为每46H通风2030MIN。实验中风机的参数如下表表22风机的相关参数名称风机型号工作电压最大工作压力排气量电机功率空气压缩机FCW58/2型220
19、V07MPA180L/MIN11KW为保证堆体温度，提高堆肥效率，本实验利用太阳能加热。加热系统原理为利用太阳热水器吸厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究5收太阳光转化为热能将水加热，热水送入发酵仓底部的加热水箱内，再通过热传递方式将发酵仓内物料加热。天气不好时，启动辅助电加热系统直接将水箱内水加热。批样1堆肥系统只采用了太阳能辅助加热，批样2是采用太阳能加热与电加热相结合的供热方式。实验装置图见下图图21卧式螺旋搅拌太阳能好氧堆肥器23各参数测定方法231温度的测定主要仪器温度计测定步骤每天在1430点对垃圾堆体进行测温。在先测完室温的情况下，分别测定两批样的堆体温度（注意温度计
20、头需要进入垃圾堆体内，否则温度不准）。232含水率的测定主要设备搪瓷方盘、培养皿、称量纸、烘箱测定步骤将所取的样品分成三份，分别称重、记录，装入搪瓷方盘铺平，放入烘箱，在1055的温度下，使水分蒸发。样品在烘箱内应干燥至恒重，使两次称重差值不超过试样重量的4。含水率（）干燥前质量（G）干燥后质量（G）/干燥前质量（G）100求三个试样的含水率平均数，得出样品的平均含水率。对进料样品、处理过程中取34次样品、出料样品都进行测定，然后绘制含水率时间曲线。233PH的测定仪器塑料瓶、蒸馏水、振荡机、PH计、容量瓶两个（1L）、电子称、玻璃棒、烧杯试剂苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、蒸馏水厨余垃
21、圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究6校准试剂PH401校准缓冲液称取在105烘过的苯二甲酸氢钾1021克，用蒸馏水溶解后稀释至1升，即为PH401，浓度为005M的苯二甲酸氢钾溶液。PH687校准缓冲液称取在45烘过的磷酸二氢钾339克和无水磷酸氢二钠353克（或用带12个结晶水的磷酸氢二钠于干燥器中放置两周，使成为带2个结晶水的磷酸氢二钠，再经130烘成无水磷酸氢二钠备用），溶解在蒸馏水中，定容至1升。测定步骤称取准备好的5G样品（干基），置于500ML瓶中，加入新鲜蒸馏水250ML。使固液比为150，加盖密封后，放在振荡机上（振荡频率11010R/MIN）于室温下，连续振荡30MI
22、N，静置30MIN后，测上清液的PH值，每次取三个平行批样测定其PH值，差值不得大于015，否则应再取12个批样重复进行试验，取中位值报告结果。234TOC的测定主要仪器油浴锅、铁丝笼、硬质玻璃试管、锥形瓶50ML、滴定管、移液管10ML、5ML、分析天平等主要试剂重铬酸钾硫酸标准溶液、硫酸亚铁标准溶液、苯基代邻氨基苯甲酸、硫酸银、磷酸溶液等操作步骤1称取001G（00005G）风干的样品，于试管中，加01G硫酸银，1000ML重铬酸钾硫酸标准溶液。在加入13ML上述溶液时，应将批样摇散，勿使结块。在试管口放一小漏斗，以防止加热时溶液溅出。2将一批试管插入铁丝笼中（内有空白样两个经500左右焙
23、烧2H后磨细到80目的沉积物批样），将铁丝笼于1755加热，待试管内溶物沸腾5MIN后，取出铁丝笼，将试管外壁的油液擦净。3将试管内的溶液及残渣倒入250ML锥形瓶中，将冲洗小漏斗及试管的水并入锥形瓶中（控制总体积为6070ML）。加入5ML磷酸溶液用硫酸亚铁标准溶液滴定至黄色大部分腿去，加入23滴苯基代邻氨基苯甲酸指示剂溶液，继续滴定至深液由紫色突变到绿色即为终点。4有机碳百分含量的计算2120003100FEOCCVVWM式中WOC沉积物干样中有机碳的含量，；CFE2硫酸亚铁标准溶液，MOL/L；厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究7V1滴定空白样时，硫酸亚铁标准溶液的用量，M
24、L；V2滴定批样时，硫酸亚铁标准溶液的用量，ML；M批样的称取量，G。235TN的测定城市生活垃圾全氮测定半微量开氏法CJT1031999（1）实验原理试样在催化剂（即硫酸钾无水合硫酸铜与硒粉的混合物）的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮，碱化蒸馏出来的氨用硼酸吸收后，以酸标准溶液滴定，计算出生活垃圾全氮含量（不包括全部硝态氮）。用还原法和非还原法测定生活垃圾的氮含量，其结果很接近，因此对生活垃圾试样全氮的测定用开氏法是科学有效的。（2）主要试剂本实验所用蒸馏水均为无氨水，所用试剂凡没有指明规格者均为分析纯浓硫酸，184G/ML浓盐酸，119G/ML
25、错误未找到引用源。无水碳酸钠（NA2CO3）基准试剂，使用前须经180干燥2H，并恒重2硼酸吸收液M/V40氢氧化钠溶液M/V002MOL/L盐酸标准溶液吸取167ML盐酸于100ML容量瓶中,并用蒸馏水稀释至刻度后摇匀,此溶液为20MOL/L盐酸溶液,吸取该溶液100ML于1000ML容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度后摇匀,然后用无水碳酸钠标定。标定准确称取已干燥过的无水碳酸钠00200G精确至00001G于锥形瓶中加入25ML新煮沸并冷却的蒸馏水和滴指示剂,用002MOL/L盐酸标准溶液滴定至溶液由绿色变为淡紫色,记录消耗盐酸标准溶液的体积,按式计算盐酸标准溶液的浓度,标定结果需用双份试料取其
26、平均值,同时做空白实验。0100021060053MMC00（VV）（VV）错误未找到引用源。式中C0盐酸标准溶液的浓度,MOL/LM称取无水碳酸钠的质量,G厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究8V试样所消耗盐酸标准溶液的体积,MLV0空白试样所消耗盐酸标准溶液的体积,ML2中和1MOL无水碳酸钠所需盐酸的摩尔数106无水碳酸钠的摩尔质量，G/MOL所得结果应表示至四位小数。甲基红溴甲酚绿指示剂分别称取03G溴甲酚绿和02G甲基红精确至001G于研钵中,加入少量95乙醇研磨至指示剂全部溶解,用95乙醇稀释至100ML，可保存一个月。催化剂分别称取100G硫酸钾,10G五水合硫酸铜C
27、USO45H2O和1G硒粉于研钵中研细并充分混合均匀,贮存于磨口瓶中。3仪器A分析天平,感量为00001GB瓷研钵C硬质开氏烧瓶,容积500MLD半微量定氮蒸馏装置E半微量滴定管,容积5MLF）锥形瓶,容积150MLG四联可调电炉4实验步骤A试样的消解称取约05G试样精确至00001G,送入干燥的500ML开氏瓶底部,加入少量的蒸馏水湿润批样,2G加催化剂和5ML浓硫酸,摇匀,瓶口盖一小漏斗,置调温电炉上低温加热,待瓶内反应缓和时约30MIN适当调高温度使溶液保持微沸,温度不宜过高,以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜,待消解液全部变为灰白稍带绿色后,再继续消解1H,停止加热使其冷却。将上
28、述冷却后的消解液全部转移到50ML容量瓶中,并用少量蒸馏水洗涤开氏瓶45次一并转移至容量瓶中,定容,摇匀,静置得到上清液A。B氨的蒸馏安装好蒸馏装置，见装置图，圆底烧瓶内加数粒玻璃珠，并检查其是否漏气后，用蒸馏水代替批样进行空白蒸馏，并通过水的馏出液将管道洗净（约30MIN）。于150ML锥形瓶中加入25ML硼酸吸收液并滴加2滴指示剂,将蒸馏装置的冷凝管末端深入到吸厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究9收液面以下1CM处,然后吸取25ML上清液A于蒸馏室内,缓缓加入10ML氢氧化钠溶液,启动蒸汽发生器,进行水蒸气蒸馏,馏出液体积约50ML时用PH试纸测馏出液为中性时,蒸馏结束,用少
29、量硼酸吸收液洗涤冷凝管末端。用已标定好的盐酸标准溶液滴定馏出液,溶液由绿色变为淡紫色,记录所用盐酸标准溶液体积。空白实验空白实验与批样测定同步进行，除不加批样外，其余操作步骤均同批样的测定，空白所消耗盐酸标准溶液体积一般不应超过01ML。5分析结果描述全氮浓度C（）00140121001000VVCM样错误未找到引用源。式中V滴定试样所用盐酸标准溶液体积，MLV0滴定空白时所用盐酸标准溶液的体积，MLC0盐酸标准溶液的浓度,MOL/L2分取倍数M样试样质量，G1401氮原子的摩尔质量，G/MOL所得结果应表示至四位小数。236有机质的测定主要仪器瓷坩埚、坩埚钳、马弗炉、石棉网、分析天平、干燥器
30、等操作步骤称取20G试样，精确至00001G，置于已恒重的瓷坩埚中（坩埚空烧2H）。将坩埚放入马弗炉中升温至600，恒重68H后移出坩埚移入干燥器中，冷却后将干锅重新放入马弗炉中同样温度下灼烧10MIN，同样冷却称重，直到恒重。12100MMMI样有机质含量（1C）式中C试样中有机质的含量，；M1坩埚和烘干试样重，G；M2坩埚和灼烧后试样重，G；CI塑料地垃圾干基中的百分比，；M样称样量，G；237微生物的测定厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究10微生物的测定用传统的平板菌落计数法。本次实验分别对真菌、细菌、放线菌进行了培养计数，除三种菌落培养时培养基和培养温度以及培养时间不同外
31、，其余操作步骤均相同。真菌的培养用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，放线菌的培养用高氏一号合成培养基，细菌的培养用牛肉膏蛋白胨培养基。真菌和放线菌置于30培养箱中培养，细菌置于37培养箱中培养。平板菌落计数法是将待测批样经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原批样中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样量，即可换算出批样中的含菌数。主要设备恒温培养箱、高压灭菌锅、无菌操作台、微波炉、锥形瓶、电炉、试管、平皿、牛皮纸、电子天平等操作步骤（1）样品的稀释称取1G批样至盛有99ML无菌水并装有
32、玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，即为110稀释液。取110稀释液注入含有9ML无菌水的试管中，另换一支1ML无菌吸管反复吹吸，此液为1100稀释液。按以上操作程序，制备10倍系列稀释批样匀液。每递增稀释一次，换用1次1ML无菌吸管。（2）接种准备好经灭菌的培养基和培养皿，分别标上不同的稀释度，每个稀释度做3个重复。用经灭菌的移液管吸取1ML菌液，倒入相应编号的培养皿中，然后即可倒入培养基15ML（温度不能太高或太低，太高易把菌烫死，太低则易凝固）。倒入后立即轻轻摇动培养皿，使培养基与菌液充分混匀，立即静止，水平放置待其冷却。凝固后即制成平板。注意在培养基冷却过程中不能摇动培养皿，否则培养基表面会凹
33、凸不平。上述过程都进行无菌操作。（3）培养观察将制作的平板分别放入相应温度的恒温箱培养。通过培养，即可见平板上长出菌落。（4）菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的菌落数。以菌落形成单位（COLONYFORMINGUNITS,CFU）表示。选取菌落数在10CFU150CFU的平板，根据菌落形态分别计数。菌落蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用3个平行平板的平均数。培养基的配置厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究11（1）真菌马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制成分马铃薯（去皮切块）300G葡萄糖200G琼脂200G氯霉素01G蒸馏水1000ML制法将马铃
34、薯去皮切块，加1000ML蒸馏水，煮沸10MIN20MIN。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000ML。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121灭菌20MIN。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。（2）细菌牛肉膏蛋白胨培养基的配制成分牛肉膏3G蛋白胨10GNACL5G琼脂1520G水1000MLPH7476制法按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NACL放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然
35、后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH值，如果PH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1MOL/LNAOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH值，直至PH达76。反之，则用1MOL/LHCL进行调节。注意PH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。将上述培养基121，20分钟高压蒸汽灭菌。厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规
36、律研究12（3）放线菌高氏一号合成培养基的配制成分可溶性淀粉20G硝酸钾1G氯化钠05GK2HPO43H2O05GMGSO47H2O05GFESO47H2O001G琼脂20G水1000MLPH7274制法配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ML。121灭菌20分钟。238蛋白酶活性的测定实验原理在一定温度下、一定时间内，利用自身蛋白酶把自身原料中的蛋白质水解成氨基酸。以100G干基所测定氨基态氮的量（克数）来衡量蛋白酶活力的数值。方法步骤称取研细均匀的样品10G，放入250ML锥形瓶中，加55温水70ML，充分摇匀，置于
37、55水浴锅中保温3H，取出后加热煮沸以破坏酶活力，冷却后定容至100ML，充分摇匀后以脱脂棉过滤，吸取滤液10ML，移至150ML锥形瓶中，加水50ML，1酚酞指示剂02ML，以01MOL/L氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色PH82，记下滴定数作为总酸，继续加甲醛10ML，用01MOL/L氢氧化钠液滴定至深红色PH85为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。结果计算10010110100W（VV）N00140蛋白酶活性（克氨基态氮/100G）（干基）式中V加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数，ML；V0甲醛空白滴定数，ML；W含水率，；N氢氧化钠标准溶液的当量数，N；0014氮的毫克当量数。
38、厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究13239脲酶活性的测定实验原理脲酶活性的测定是以尿素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本实验是以100克样品所测的氨氮的毫克数表示。主要试剂（1）甲苯（2）10尿素称取10G尿素，用水溶至100ML。（3）柠檬酸盐缓冲液（PH67）184克柠檬酸和1475克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1MOL/LNAOH将PH调至67，用水稀释至1000毫升。（4）苯酚钠溶液（135MOL/L）625克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和185毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NAOH溶于100毫
39、升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。（5）次氯酸钠溶液用水稀释试剂，至活性氯的浓度为09，溶液稳定。（6）氮的标准溶液精确称取04717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ML，得到1ML含有01MG氮的标准液。标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10ML，定容至100ML，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ML移至50ML容量瓶，加水至20ML，再加入4ML苯酚钠，仔细混合，加入3ML次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在分光光度计上于578NM处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线
40、图。方法步骤（1）称取5G过1MM筛的风干样于50ML三角瓶中。（2）向三角瓶中加入05ML甲苯并放置15分钟。（3）之后加入1ML10尿素溶液和3ML柠檬酸缓冲液（PH55），并仔细混合。（4）将容量瓶放入30摄氏度恒温箱中，培养24H。（5）培养结束后，用热至30摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。（6）显色吸取3ML滤液于50ML比色管中，加入10ML蒸馏水，充分震荡，然后加入4ML苯酚钠，仔细混合，再加入3ML次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色。（7）1H内在（靛酚的蓝色在1H内保持稳定）在分光光度计上用1CM液槽，于578
41、NM处将显色厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究14液进行比色测定。结果计算土壤脲酶活性以24小时后100G土壤中NH3N的毫克数表示。M（X样品X无土X无基质）10010式中M土壤脲酶活性值；X样品样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数；X无土无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数；X无基质无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数；100样品定容的体积与测定时吸取量的比值；10酶活性单位的土重与样品土重之比值；2310过氧化氢酶活性的测定实验原理过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子
42、的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液在酸性条件下滴定多余的H2O2。即可求出消耗的H2O2的量。主要试剂（1）10H2SO4。（2）02MOL/L磷酸缓冲液PH78。（3）002MOL/L高锰酸钾标准液称取KMNO4AR31605G，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ML，用01MOL/L草酸溶液标定。（4）01MOL/LH2O2市售30H2O2大约等于176MOL/L，取30H2O2溶液568ML，稀释至1000ML，用标准002MOLKMNO4溶液在酸性条件下
43、进行标定。（5）01MOL/L草酸称取优级纯H2C2O22H2O12607G，用蒸馏水溶解后，定容至1L。方法步骤（1）酶液提取取样品25G加入PH78的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ML容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000R/MIN离心15MIN，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（2）酶反应过程取50ML三角瓶4个3个测定，1个对照，测定瓶中加入酶液25ML，对照瓶中加入煮死酶液25ML，再加入25ML01MOL/LH2O2，同时计时，于30恒温水浴中保温10MIN，立即加入10H2SO425ML。（3）标定厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活
44、性变化规律研究15用002MOL/LKMNO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色在30S内不消失为终点。（4）结果计算酶活性用每克样品1MIN内分解H2O2的毫克数表示酶活MG/GMIN（AB）VT17FWV1T式中A对照KMNO4滴定毫升数ML；B酶反应后KMNO4滴定毫升数ML；VT酶液总量ML；V1反应所用酶液量ML；W批样鲜重G；171ML01MOL/L的KMNO4相当于17MGH2O2。24实验技术路线本次实验是一个从样品的采集破碎，调理分装，接着好氧堆肥过程，最后数据测定统计及分析的一个过程，下图是实验技术路线图。图22实验技术路线图3结果与讨论31温度样品的采集与破碎样品的调理混
45、合及分装太阳能高温好氧堆肥设备运行过程中厨余垃圾的相关数据测定及数据统计建立堆肥过程中各参数随时间变化规律，分析其对厨余垃圾降解的影响完成“厨余垃圾堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究”厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究16图31堆体温度变化曲线图31中，室温一直维持在10以下，第7到10天甚至才12，但是，堆肥开始后堆体内温度基本一直维持在20以上。堆肥初期由于堆肥中的有机质在微生物的作用下用于微生物的细胞合成，同时分解为CO2和水，在此过程中产生大量热量促使堆体温度上升，因此批样1和批样2第14D都处于升温状态。批样1从第4天温度达到40，进入中温堆肥阶段，中温状态维持3天，
46、并没有进入高温堆肥的状态温度就开始下降。而批样2堆肥1天就达到40，进入中温堆肥，堆肥第6D达到最高温65，达到高温堆肥所需温度，并且在高温堆肥状态维持了8天，经过高温阶段大量微生物死亡，酶活降低致使有机物降解速度下降，产生的热量减少，导致堆体温度有下降的趋势。批样1和批样2堆肥效果相差甚大主要原因分析如下批样1堆肥系统仅采用太阳能辅助加热，由于外界温度偏低，且连续雨雪天气，因而太阳能集热器吸聚热量低，对堆体的热量提供不稳定，甚至不能提供热量，并且物料含水率较高，加上鼓入的冷空气与堆体内高温、高湿空气交换，带走大量热量，堆体温度相对不高，处于中温状态；在没有阳光时（如第7D），堆体环境温度（水
47、箱内）持续下降，过了升温期的堆体由于易降解有机量的减少发热能力降低，造成堆体温度迅速下降。而批样二采用太阳能加热与电能加热相结合的方式，当外界无阳光时，电加热系统启动，因而批样2堆体维持较高温度。国家标准GB795987规定堆体温度最高温度在5055以上持续57D方能达到杀灭各种有害微生物的要求，因此批样2满足无害化要求（50以上维持8D）。32含水率水分的多少应保证微生物的生化反应能以合适的速率稳定的进行，水分过高会引起堆层中空隙减少，氧气交换降低，微生物的活性降低。同时水分又参与溶解有机物，参与微生物的新陈代谢11。由于批样2加了水葫芦，批样2初始含水率明显低于批样1。图32中批样1的含水
48、率一直呈下降趋势，而批样2是先上升后下降的趋势。其原因主要因为厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究17堆肥初期垃圾中有机物质在好氧的情况下降解，原有机物中的机构附着水分，毛细管水分和部分溶胀水分开始渗出，加上微生物消化所产生的水分使堆肥的含水率增加（批样2第13D）。直到堆肥第10D，批样1的含水率由初始的86下降到671，批样2由初始的608下降到525，下降率分别为2198和1365，两者的下降率都比较低，其主要原因是该堆肥装置属于封闭式的，密闭性和保温效果较好，水蒸气遇到发酵仓顶部冷凝下来又重新落回到物料上，水分不易快速散失。另外，除了物料本身的水分外，堆肥过程中微生物降解有
49、机物也会产生水分，发酵仓下部没有专门收集垃圾渗滤液的通道而是与气流缓冲腔共用一个腔，腔外水箱温度较高，造成渗滤液蒸发随通风过程进入发酵仓内，而没有及时被排出。图32堆肥过程含水率变化曲线33PH图33堆肥过程PH值变化曲线厨余垃圾好氧堆肥过程中微生物及酶活性变化规律研究18PH值是影响微生物生长的重要环境因素之一，细菌、放线菌适宜在PH值为中性或微碱性的环境生长，真菌适宜在PH值为中性或微酸性环境生长。PH值大小不仅影响有机物质分解、矿物质的溶解、氧化还原及微生物活动强度，而且直接影响酶参与的生化反应速度20。图33中得出，两批样PH变化规律基本一致，都呈先下降后上升的趋势。堆肥开始后，堆料中的有机质在微生物的作用下迅速分解成水、CO2、有机酸和氨，有机酸在堆体内累积，另外，堆体的含水率很高，所以二氧化碳溶于水后产生H2CO3，H2CO3很容易水解，水解产生的H、HCO3呈酸性，因此初期微生物活动分解有机质产生的酸多于氨，使两个批样的PH均下降，第3D达到最低，PH分别为407，44；随后310D，随着发酵的进行，温度的上升，有机质在微生物的强烈作用下分解产生
