1、网织红细胞计数 红细胞沉降率测定血液分析仪及其临床应用,第二章 血液一般检验（三） BLOOD ROUTINE TEST,武汉科技大学天佑医院检验科李 明,网织红细胞(reticulocyte，Ret)是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，晚幼红脱核后，胞质内含有残存的RNA/DNA等嗜碱性物质，在煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色时，呈现出浅蓝或深蓝色网织状。 属于尚未完全成熟的红细胞(当嗜碱性物质消耗殆尽后才被视为成熟红细胞)，一般为89.5m。,网织红细胞计数,【质量保证】 以手工计数法为重点。 1染料选择,【质量保证】 2正确辨认网织红细胞 外周血中网织红细胞主要为型，凡含有2个以上
2、网织颗粒的红细胞均应计为网织红细胞。 3网织红细胞计数方法 (1)Miller窥盘： (2)显微成像系统：计算机和细胞形态分析软件， HFR：粗颗粒堆积成网状。 MFR：粗颗粒在10个以上，或细小颗粒超过15个。 LFR：细胞内含15个以下细小颗粒,网织红细胞百分数： 成人和儿童:0.0050.015 新生儿: 0.020.06网织红细胞绝对数： 成人和儿童: (2484)X109L,参考值,临床意义,1评价骨髓增生能力，判断贫血类型。 (1)网织红细胞增多：表示骨髓造血功能旺盛，各种增生性贫血（HA、IDA及巨幼贫）及失血性贫血；某些贫血治疗的恢复期明显增多，如IDA补充铁剂后。 (2)网织
3、红细胞减少：常见于再生障碍性贫血(AA) (3)鉴别贫血：,临床意义,2评价疗效 (1)观察贫血疗效：贫血随访 缺铁贫或巨幼贫有效治疗后，23d后Ret开始上升，710d达到最高峰(约10)，2周后渐降至正常。 (2)骨髓移植后监测骨髓造血恢复： 骨髓移植后第21天，如Ret大于15X109L，常表示无移植并发症； 若骨髓开始恢复造血功能，首先HFR和MFR上升，其次为网织红细胞计数值上升。,临床意义,3放疗和化疗的监测 指导临床适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期HFR和MFR降低，而后网织红细胞数值降低；停止放、化疗，骨髓功能恢复后，这些指标依
4、次上升。,临床意义,红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)简称血沉，指在规定条件下，离体抗凝全血中的红细胞自然下沉的速率。 血沉过程一般分为3期：缗钱状红细胞形成期，一般要经过数分钟至10min。快速沉降期，形成缗钱状红细胞以等速下降，约40min。 细胞堆积期，又称缓慢沉积期或挤紧期，此时红细胞堆积在试管底部。,红细胞沉降率测定,检测原理1魏氏法(Westergren法) 将离体抗凝血液置于特制刻度测定管内，垂直立于室温中，记录1h时红细胞层下沉的距离(上层血浆的高度 )，用毫米(mm)数值报告。,检测原理2血沉仪法 血液经抗凝静置后，红细胞下降
5、，红细胞与血浆分离，其界面随时间而下移，血沉仪用发光二极管和光电管检测此界面的透光度改变，得到血沉值并显示红细胞沉降高度H与对应时间t相关的Ht曲线。,方法学评价 1手工法 魏氏法：为传统方法，为国内规范方法 . EDTA或枸橼酸钠抗凝血液标本充分混合后，吸入魏氏血沉管200mm刻度处，将血沉管垂直室温放置至少60min，应避免振动、风吹、阳光直射，然后读取柱中红细胞沉淀上透明血浆层约lmm处结果。ICSH方法: 参考方法, 用于验证其他方法的可靠性。,方法学评价2仪器法 血沉仪可动态记录整个血沉过程的变化，描绘出红细胞沉降的曲线， ESR测定在30min或lmin内得到检测结果，大大缩短了临
6、床等候报告的时间。,质量保证 红细胞数量、表面积、厚度、直径、血红蛋白量和血浆中各种蛋白比例。影响红细胞缗钱状形成的主要因素有： 1.血浆中各种蛋白的比例，与总蛋白浓度无关。清蛋白带负电荷，球蛋白与纤维蛋白原带正电荷，红细胞因唾液酸而带负电荷，彼此排斥。 促缗钱状聚集的物质：纤维蛋白原球蛋白球蛋白、胆固醇、甘油三酯等； 清蛋白及卵磷脂则抑制红细胞缗钱状的形成。,3血沉管与血沉架 血沉管与血沉架规格必须符合标准。血沉管置血沉架上应完全垂直，倾斜时，会加速沉降。4.血标本 避免脂肪血；抗凝剂浓度增加使血沉减慢，每周配制1次，置冰箱血与抗凝剂比例要准确。抽血应在30s内完成，不得混入消毒剂，避免形成
7、凝块。,5温度 1825的室温下测定。室温过高时血沉加快，可以按温度系数校正。 6其他 注射器、试管、血沉管要干燥洁净，以避免溶血。7及时测定 采血后应尽快进行测定，室温下，标本置放时间不应超过4h，置4冰箱时枸橼酸钠抗凝血可6h, EDTA抗凝血可24h. 。,质量保证,参考值50岁：男性85岁：男性 30mmh,女性 42mmh。儿童 10mmh。,血沉是较为常用而缺乏特异性的试验， 对判断机体有无感染、组织损伤、坏死或某些疾病有无活动、进展、恶化及肿瘤浸润、播散、转移等都有一定的价值。 血沉测定常作为疾病是否活动的监测指标。,临床意义,1血沉增快(1)生理性：女性高于男性。妇女月经期由于
8、子宫内膜破损及出血，血沉略有增快；妊娠3个月以上可因生理性贫血及血浆纤维蛋白原增加使血沉增快；老年人，特别是70岁以上的高龄者，多因纤维蛋白原增高而血沉增快。,临床意义,(2)病理性 1)各种炎症：感染是血沉加快最常见的原因。 急性细菌性炎症时，由于血中急性时相反应蛋白增多，包括1胰蛋白酶、2巨球蛋白、C反应蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原等。在炎症发生后23d可出现血沉增快； 慢性炎症，如结核病、结缔组织炎症、风湿热等，于活动期常见血沉增快，病情好转时血沉减慢，非活动期血沉可正常。,2)组织损伤及坏死： 范围较大的组织损伤或手术创伤常致血沉增快，若无合并症，一般23周内恢复正常； 心肌梗死时，于发
9、病后34d可见血沉增快(急性时相反应蛋白)，并持续1 3周，而心绞痛时血沉多正常。,3)恶性肿瘤： 血沉可作为恶性肿瘤的普查筛选的辅助指标， 通常迅速增长的恶性肿瘤血沉均增快，良性肿瘤血沉多正常。 恶性肿瘤手术切除后或治疗较彻底，血沉可趋于正常，复发或转移时又可增快。,4)高球蛋白血症： 多种因素导致的免疫球蛋白增高可见血沉增快，如系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、亚急性感染性心内膜炎、肝硬化、慢性肾炎等。 高粘滞性综合征时，血沉可不增快甚至减慢。,5)贫血：贫血患者血红蛋白低于90gL时，血沉可轻度增快，并随贫血加重而增快。6)高胆固醇血症：如动脉粥样硬化、糖尿病、肾病
10、综合征、粘液性水肿、原发性家族性高胆固醇血症等，血沉常常增快。,2血沉减慢 一般临床意义较小，主要见于真红、低纤维蛋白原血症、充血性心力衰竭、红细胞形态异常(如异形红细胞、球形红细胞、镰形红细胞)。,血液分析仪及其临床应用,hematology analyzer and clinical application,血液分析仪及其临床应用,发展简史检测原理(库尔特原理)血液细胞分析仪（三分类法）原理 及临床应用（细胞直方图的形成）血液细胞分析仪的发展（五分类法）,一、发展简史,1590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜（图1） 1610 年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来
11、被列文霍克改进成为原始的显微镜。 1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人，开始进行红细胞计数则是200 年后的事情了。 1855年发明了计数血细胞的计数板（Neubauer计数板）一直沿用至今。 而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。,最初的血细胞计数仪是一种单参数测定仪器，只能对血液中的红细胞和白细胞进行计数，并且需人工切换。最早生产的血球计数仪为Coulter 型 1958 年以Coulter 命名的专门从事颗粒性测量计数的仪器公司，库尔特电子（Coulterlectronics ）公司成立。,血液分析仪发明者库尔特先生,
12、35岁的美国人库尔特发明了粒子计数技术；50年代初期，血细胞计数仪开始应用于临床。科技为人类健康服务，热心社会公益事业。,库尔特先生1913-1998,此后，欧洲、日本也开始了血液细胞计数仪的开发和研制,我国在60年代中期也开始了这种仪器的开发和生产。 我国1965年在上海也生产了简单的血细胞计数仪，1975 年北京医疗仪器厂也开始模仿设计自己的简单的红白细胞计数仪。 血细胞计数仪（Blood Cell Counter） 血液细胞分析仪(Hematology Analyzer),血液分析仪,二、检测原理,库尔特原理 库尔特原理是利用电阻抗法测量细胞的数量和体积。其内容为：血细胞是电的不良导体，
13、通过电场（计数小孔）时产生电阻， 将电阻变化转化成脉冲信号，感应器通过检测脉冲的数量及大小，从而计算出通过小孔的细胞数量及体积。（血细胞计数和分析中最为经典的原理）,三、三分类法原理及临床应用,（一）三分类法(体积分类法）原理 各种单纯电阻法血细胞分析仪的原理即为电阻抗（库尔特原理）原理。,血细胞直方图概念： 在细胞通过小孔计数时，感应器收集脉冲的大小及数量，转换为相应的细胞体积和数量，并在坐标上表示出来。坐标的横轴(X)代表体积(FL)，纵轴(Y)代表相对数量，将各点用光滑的曲线相连，就是直方图。即直方图是可以表示出细胞群体体积分布情况的图形。,细胞直方图作用,为临床提供直观的检验结果。为检
14、验人员监控仪器工作状态及检测 结果提供了直观的图形。注意：不同类型仪器直方图的图形也有差异。,（二）各种直方图的临床应用 1、白细胞直方图及其临床应用 白细胞直方图原理： 经过特殊溶血剂处理的白细胞，可将特定的细胞群进行处理，使得绝大多数淋巴细胞体积缩小，使得中性粒细胞体积适当增大。因此在白细胞分布直方图上出现两个明显的细胞分布峰。,在三分类血细胞分析仪上，白细胞直方图形态为“两峰一谷”： 小细胞区（3590fl）：主要为淋巴细胞，包括成熟淋巴细胞以及异性淋巴细胞。 中间细胞区（90160fl）：包括成熟单核细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞以及原始和幼稚细胞。 大细胞区（160450fl）：代表成熟中
15、性粒细胞。,白细胞直方图的变化，可评价血液中白细胞群体的变化，但这种变化的细胞图并无特异性，某一类白细胞的增多或减低均可使直方图产生相似的变化。 因此，异常白细胞直方图只能提示白细 胞分群之间比例变化或可能出现异常细胞，故要求用显微镜复查血涂片。,典型病例介绍,急性淋巴细胞白血病,急性淋巴细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病,急性粒细胞白血病AML-M3,嗜碱粒细胞白血病,嗜酸粒细胞增多症,慢性粒细胞白血病,慢性粒细胞白血病,慢性粒单细胞白血病,单核细胞增多症,粒细胞增多,2、红细胞直方图及其临床应用,在36-360fl范围内分析红细胞，正常红细胞主要分布在50-200fl。 正常直方图上可见两个细
16、胞群体：50-125fl区域有一个几乎两侧对称、较狭窄的正态分布曲线；主峰右侧约在125-200fl区域的细胞，为大红细胞和网织红细胞。其中曲线峰顶对应的是MCV,而曲线基底的宽度大致反应RDW。,直方图的临床应用,红细胞直方图在贫血中的应用 不同贫血红细胞体积的变化，使红细胞 体积分布图形发生变化，结合其它参数对 鉴别诊断颇有价值（根据MCV和RDW可对贫血进行分类）： 1. 小细胞性贫血 2. 大细胞性贫血 3. 正细胞性贫血,红细胞直方图有关的两个参数,红细胞直方图有关两个参数是MCV，RDW 1、MCV表示红细胞平均体积， MCV变大，红细胞峰右移； MCV变小，红细胞峰左移。,2、R
17、DW,RDW由血细胞分析仪测量获得，是反映周围血红细胞体积异质性的参数，它的统计学实质是红细胞大小的变异系数(CV)。当红细胞通过小孔的一瞬间，计数电路得到一个相应大小的脉冲，不同大小的脉冲信号分别贮存在仪器内装计算机的不同通道，计算出相应的体积及细胞数，统计处理而得RDW。在MCV相似的情况下，RDW越大，红细胞峰就 越宽。,小细胞性贫血,（1）RDW轻度（2）RDW正常,小细胞性贫血,RDW明显也见于IDA治疗有效时,大细胞性贫血（RDW正常）,见于溶贫白血病前期再障巨幼贫,大细胞性贫血（RDW轻度）,见于叶酸，维生素B12缺乏引起的巨幼贫,大细胞性贫血（RDW明显）,见于巨幼贫叶酸，维生
18、素B12治疗初期,正细胞性贫血（RDW正常）,见于慢性病急性失血骨髓纤维化骨髓发育不良,血小板体积范围在2fl30fl之间，平均体积为67fl，所以血小板直方图是一个偏态曲线。,3、血小板直方图及其临床应用,（一）血小板直方图的临床应用 由于红细胞与血小板的检测在同一通道， 小红细胞和细胞碎片，血小板自身的聚集对血小板计数及平均血小板体积的影响很大，血小板直方图能反映这些变化，可根据图形的变化，了解血小板计数的准确性。,所以认真分析血小板直方图的变化，找出干扰直方图的原因，不仅有利于疾病的诊断，而且可以甄别血小板计数的正确性。 有些仪器专门设置了增加血小板准确性的技术，如鞘流技术、浮动界标、拟
19、合曲线等。,异常血小板直方图,峰右移,左右侧起点较高,异常血小板直方图,右侧呈脱尾状,峰左移,其他计数原理的血细胞分析仪,1. 激光法：应用单束激光照射到经过鞘流技术处理的排列成一列的单个细胞上，根据细胞阻断激光束的频率以及PMT收集到的激光折射信号，对细胞的数量、体积进行分析的仪器。,其他计数原理的血细胞分析仪,2. 离心式血液分析仪：将血液充入到含义特殊试剂的毛细管内，在专用离心机上离心，根据血细胞中各种成份的比重不同而分布在不同的细胞层内的原理，血细胞被吖啶橙染色，各细胞层会有明显的颜色差异，然后将毛细管放在特殊的判读机上对不同的细胞层进行定量分析.3. 移动光学法：早期的光学法血细胞计
20、数仪器， 采用普通光源，血细胞在移动过程中被检测到，不能分析细胞的大小和内部结结构，因此仅可进行红细胞和白细胞的计数,四、白细胞五分类法,进入90年代中期以来，国外许多厂家已经不满足于三分类型的血细胞分析仪，逐步开始研制和推出具有五分类或更多项白细胞分析技术的全自动型血液分析仪器，比较著名的厂家有：Coulter、Sysmex、ABBOTT、Bayer、ABX等。各厂家使用的白细胞分类技术多样化，复杂化，使得白细胞分类技术更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品（试剂）价格的增加。,具有白细胞五分类功能的血细胞分析仪器是指：通过各种物理和化学技术对白细胞进行分析，以获得外周血液中白细胞
21、的五种常见类型的百分率和绝对值的测定结果，此外还应该具有对出现异常白细胞的提示和初步分类功能。,五分类法原理,（一）五分类VCS技术,运用V、C、S三种探针,在流式通道的某一位点,对通过的单列白细胞，进行逐个的、同时的、三重的检测，以及三维分析,以确定其亚群性质。V-低频波，分析细胞体积；C-高频波，分析细胞核型；S-激光，分析细胞的颗粒特性。,接近原态的WBC分析,接近原态的白细胞,进入流式通道,VCS检测,八千多个白细胞逐个、直接、同时地在流式通道内接受VCS三重检测，得到各自的三维座标值,VCS,十余种异常细胞的报警提示,VCS法白细胞分类散点图,（二）细胞化学技术：核酸荧光染色,区别于
22、酸碱染色、酶染色、糖原染色核酸染色物质（荧光物质）Polymethine （聚次甲基）Oxazine (口恶嗪）不同的细胞亚群、不同的成熟阶段，其核酸的含量，核酸的结构，DNA/RNA的比例不同，表现不同的着色性。与半导体激光有很好的适配性，633nm激发荧光,流式通道和光路系统,半导体激光器 (=633nm),双色分光镜,光电倍增管（荧光信号）,流动室,光电倍增管（侧向散射光信号）,光电二极管（前向散射光信号）,核酸染色和信号分析,血细胞分析仪的发展近况和展望,1、血常规检验多参数化 2、多功能合成扩展 3、检测速度的提高 4、方法的改进和进展 5、应用的方便性,注意：病理因素对血液分析仪使
23、用的影响,1. 严重黄疸或脂血使血红蛋白结果假性增高。2. 血液中白细胞显著增高而影响红细胞数。3. 有核红细胞出现而影响白细胞计数。4. 某些新生儿或某些肝病病人红细胞膜质类 异常，抗溶血剂作用，红细胞溶解不完全 而使白细胞和血小板计数偏高。,5. 多发性骨髓瘤的M蛋白增多时，M蛋白可与溶血剂发生反应，红细胞溶解不完全而使白细胞和血小板计数偏高。6. 各种疾病引起的血栓前状态使血小板易于聚集，使血小板计数结果假性减低。7. 红细胞冷凝集可使红细胞结果假性减低， 白细胞假性增高(电阻抗法)和MCV假性增高。,结束语,目前血细胞分析仪越来越普遍的应用于各级医院的常规作中，但是并不是说所有的结果都
24、是准确无误的，目前在血细胞形态学方面，无论是五分类还是更多的分类，甚至是具有专门幼稚细胞分析通道的仪器，仍然不能根本解决血液细胞形态学的问题，仍然不能完全以仪器分类结果彻底取代人工分类。此外仪器一些固有的产生误差的因素还没有彻底解决，某些影响仪器计数准确性的个别因素还存在，或某些仪器具有设计上的缺陷和应用上的局限性，因此无论是细胞计数还是多种参数的分析结果仍然会有问题发生。不要总是相信仪器，要认真对待每个实验样品和结果，分析判断这个结果，检验工作者要对仪器的性能，质量控制，局限性，常出现的故障，特别对直方图和五分类的散点图有深刻的了解，善于发现问题和解决问题。这一切都有待于通过人们在熟练掌握仪器的性能和不断提高的自己的知识水平上，通过扎实的的显微镜下对血细胞形态学认知的基本功来解决问题。,面对问题时，如何解释？,一个实验室医学工作者没有与临床沟通和对话的能力是不能生存的,思考题,1.手工显微镜计数红细胞已不常用，但为什么 仍不能被淘汰？2.简述细胞直方图的定义与作用。 3.简述Ret的定义及其临床意义。4.怎样理解Ret用于临床鉴别三种常见贫血类型的思路？5.简述ESR的定义及其临床意义。,谢谢！,
