1、肉毒杆菌与肉毒素专题,小组成员： 周业丰 王露 刘超 刘雨佳 周婷 何帅 王晶晶 田晶 陈星 余 洁 周芬 喻靖,2013年8月3日，新西兰最大乳品公司恒天然集团发布消息，称该公司一个工厂2012年5月生产的浓缩乳清蛋白检出肉毒杆菌，可能受污染的产品用于婴儿奶粉、儿童成长奶粉和运动饮料的生产。新西兰当局宣佈全球召回1000吨可能遭到污染的乳制品。,目录,1 基本介绍,2 毒害及中毒机理,3 检测,本文目录结构,4 应用及展望,1896 年 Vahermengen 从腊肠中毒研究中，首先分离出肉毒梭菌 并证实它能在厌氧环境中生长 且可产生外毒素 肉毒毒素1910年获悉肉毒毒素在抗原性上有所不同,
2、 按免疫学上的差异可分为 A B C D E F G 等7 个型别, 因而将肉毒梭菌也分为对应的 7 个型,发展史,肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌属 ,具有该菌的基本特性: 厌氧、杆状、形成芽孢 、G+ , 肉毒毒素 。,培养特性：在蛋黄培养基上菌落周围出现混浊圈 。,概况,广泛分布于土壤、淤泥、动物粪便等，其中土壤为重要污染源，它可借助食品、农产物、禽类、海产品、水果等传播到各地,最适pH：6.6-8.2， 当pH9.0，不能繁殖,pH,温度,生长最适：25-37，产毒最适20-25 ， 低于15 或高于55 ，肉毒梭菌芽孢不能繁殖，不产生毒素,危害污染，产毒条件,特性,肉毒梭菌作为食品安全
3、监测中的指标菌,肉毒梭菌形成的芽孢对于高温的抗性,肉毒梭菌产生的肉毒素对酸的抗性,肉毒梭菌能够厌氧、低温生长,肉毒素的毒性,肉毒毒素是迄今已知的毒性最强的物质，其小鼠LD50介于0.11ng/kg。纯化结晶的肉毒毒素1mg能杀死2亿只小鼠，对人的致死剂量约0.1g。 其毒性是KCN的10000倍。外毒素，活体肉毒杆菌是无法释放肉毒素的，细胞裂解后释放前体毒素,毒性,不稳定因素,温度、湿度，空气和光照都会使毒素降解常规的消毒方法既能使其灭活 氯， 加热85C 5min人与人不能传播存在肉毒素抗毒素 （但对已经存在的症状无效）对碱性溶液很不稳定,肉毒素的毒害及作用机理,引起肉毒中毒的食品，因饮食习
4、惯、膳食组成、制作工艺不同而有差别： 美国：以罐头食品引起中毒为主 日本：以鱼制品中毒较多 欧洲：以腊肠、火腿和保藏的肉类为主 我国：则是与发酵食品有关，如自制豆酱、豆腐乳和面酱等，有少数发生于各种不新鲜肉、蛋、鱼类食品。 其次，薄膜包装食品因其保存环境有利于肉毒梭菌繁殖，也能引起中毒。 另外，若肉毒梭菌毒素附着于水果、蔬菜和谷物或厨具上亦可引起中毒。,食品污染分布,1、 潜伏期：数小时至数天不等，一般为1248 h，长者可达8-10天，主要决于动物种类和摄入毒素的量。 2、主要表现为运动麻痹症状：视力减弱、全身无力、伸舌和张口困难、抬头费力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。 3、发病快：食入毒素后，短
5、的经过6 h，长的210 天开始发病。肉毒中毒死亡率较高，一般为20-40%,中毒特征,肉毒素的结构,通过培养分离得到的毒素以前体毒素的形式存在：神经毒素(Bont)、血凝素(HA)、非血凝素(NTNH)、RNA 神经毒素(Bont)：神经元底物特异性的催化活性 非毒素组分：主要是起到保护毒素活性的作用 血凝素：维持毒素三维结构的稳定 还可能协助毒素穿过肠壁进入血液和淋巴循环,肉毒素结构,前体毒素900 KD 复合体HA (Haemagglutinin) ,血凝素NTNH non-toxic non-haemagglutinins 非血凝素蛋白,以锌肽链内切酶实施毒效,血凝素维持毒素三维结构稳
6、定影响结构因素：热变性，碱性条件空气/液体介面形成的气泡改变毒素形态,NH2,NH2,COOH,S-S,HeavyChain重链,LC轻链,Zn2+,LC中含有1个Zn2+结合序列Bont必须结合1个Zn2+才有活性；可用重金属螯合剂使其失活Zn2+可被其它二价离子取代形成金属替换毒素,肉毒素结构Zn2+,神经递质的释放,Bont的抑制作用,神经节苷脂,双受体假说,结合蛋白,A、B、E型研究证明,Bont通过酸性小泡 胞吞进入神经元细胞内,Bont 轻链逃离,3种假说,管道模型,裂缝模型,裂解模型,Bont的导入,Bont过特异性切割SNARE系列蛋白，抑制神经递质释放,机理总结总结,注意食品
7、来源 注意个人卫生及食品处理 预防婴儿伤口感染 可用肉毒梭菌类毒素预防注射：1ml/次，皮下注射，1次/周，共注射3次。 用食者发生肉毒中毒症状：应立即注射多价肉毒抗毒血清1000-2000U，并去医院就诊，以防发病。,预防措施,肉毒杆菌的检测方法,中华人民共和国出入境检验检疫行业标准（SN/T2525-2010）-食品中肉毒梭菌的PCR检测方法,原理,样品,增菌培养分离,提取DNAPCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,易蔓延生长、有不规则边缘，斜射光照射有虹彩样厌氧培养，需用石蜡油密封,制样增菌,分离纯培养物,制备模板DNA,实验组:采用针对A、B、E、F型肉毒梭菌肉毒毒素基因设计的特异性引物进行多个
8、PCR扩增，每个PCR反应管检测一种类型。对照组：以非肉毒梭菌基因组DNA为阴性对照，无菌水为空白对照，含有、型肉毒梭菌的基因组DNA作阳性对照。,PCR扩增,阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带。PCR结果阴性，可报告未检出、型肉毒梭菌。若结果为阳性则要进行确证试验：确证试验结果为检出肉毒梭菌，则报告检出某型（、型）肉毒梭菌确证试验参照GB/T4789.12-2003,结果判定,肉毒毒素的检测,小鼠生物学实验法1.样品处理： 液体不用处理直接离心得上清液，固体和半流动检样加明胶磷酸盐缓冲液，浸泡，研碎后离心得上清液。调PH至6.2，加10%胰酶（9:1v/v）混匀，
9、得胰酶激活处理液。2.检出试验： 取上清液和胰酶激活处理液分别注射（0.5mL）小鼠三只，观察四天。阳性：24h内发病，死亡主要症状：竖毛，四肢瘫软，呼吸困难最终死于呼吸麻痹。,将阳性试验样品分成三份： 第一份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清混匀， 第二份加等量明胶磷酸盐缓冲液混匀，煮沸10min, 第三份加等量的明胶磷酸盐缓冲液混匀。三份混合液分别注射（0.5mL)小白鼠两只，观察4d。阳性：若一二两份样受试小鼠存活，而第三份死亡，则可判定肉毒素存在,确证实验,取经过确证实验的阳性样品，用明胶磷酸盐缓冲液做成5、50、500、5000倍的稀释液，各注射两只小鼠（方法同上）。根据动物死亡情况计算
10、大体的毒力（最小致死剂量MLD/mL或MLD/g)例：5、50、500倍的稀释液致使小鼠全部死亡，5000倍稀释液的受试动物全部存活，毒力大致为1000-10000MLD/mL。,毒力测定,将样品稀释至10-1000MLD/mL范围分别与各单型肉毒抗毒诊断血清等量混匀，注射小鼠（方法同上），以缓冲液为阴性对照哪组实验小鼠存活，即说明该毒素是哪一种类型,定型实验,应用及展望,应用,眼睑痉挛*,神经肌肉,美容*,多汗症*,美容,美容,除皱纹,瘦脸(腿),动态皱纹：36个月,衰老 X,其他 X,肌肉萎缩,弊端,疼痛、麻木、肿胀,表情呆板、肌肉瘫痪,恶心、过敏,展望,降低其免疫反应利用重链的跨膜转运机制将药物带入细胞内,
