1、酶联免疫检测技术简介血液筛查试剂特点及发展历程,北京万泰生物药业股份有限公司汪 月 才 2012年3月,一、酶联免疫检测技术简介,什么是ELISA?,免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质 。 ELISA是一种免疫测定。,基础定义,抗原（Antigen）：能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗体（Antibody）：能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。机体被微生物感染后，先
2、产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。,重要指标,灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。特异性：鉴别阴性标本的能力。精密度：指对同一个标本进行重复分析，其结果间的符合率。,重要指标,稳定性：指在效期内试剂质量参数的变化。一般用非储存条件下较高温度进行破坏性实验数天，参观各质量参数的变化，一般37 1天相当于445天,还有2-8长期稳定性。质控血清：指为了对实验结果进行控制而配制的血清。一般用无溶血无脂血的血清或血浆。本底：指底色，如HBsAg ELISA试剂盒，阳性显色、阴性不显色，本底
3、就是阴性显色的情况；,ELISA检测方法,1.夹心法. 2.间接法. 3.竞争法. 4.捕获法.,夹心法,双抗原夹心：固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗原Ag* Ag-Ab-Ag* + 底物(TMB)显色双抗体夹心：固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)显色,间接法,固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标二抗Ab* Ag-Ab-抗Ab* + 底物(TMB)显色,竞争法,固相(包被)抗原Ag + 样品(无抗体Ab) + 酶标抗体Ab* Ag-Ab* + 底物(TMB)显色,捕获法,固相-抗IgM抗
4、体(抗) + 样品(IgM) 抗-IgM + 酶标抗原Ag* 抗-IgM-Ag* + 底物(TMB)显色,与其他检测方法比较,二、血液筛查试剂特点及发展历程,1、人类免疫缺陷病毒诊断试剂,HIV ELSIA试剂的发展,第三代检测试剂简介,全称：人类免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗体诊断试剂盒方法：双抗原夹心酶联免疫法（第三代）检测对象：血液标本中的HIV总抗体原料：基因重组（万泰和厦大合作研制），包被GP41、GP120、GP36，片段齐全。检测窗口期：20天左右,基 因 重 组 多 表 位 嵌 合 抗 原,对HIV-2型阳性出色的检测能力,试剂盒内设置有HIV 型和型阳性对 照，为国产试剂首
5、创，我们使用美国BBI 血清盘Panel202对万泰试剂进行考核。,对HIV O亚型的检测,O亚型血来源于美国BBI,超强的抗干扰能力,临床研究显示，多种其他疾病潜在干扰因素血清标本均不会影响万泰两步法HIV诊断试剂盒的灵敏度和特异性，适合临床使用,23,第四代诊断试剂简介,HIV-Ab与HIV-Ag双系统检测 HIV-Ag和HIV P24抗体共同包被 双抗原夹心法检测HIV-Ab 双抗体夹心法检测HIV-Ag生物素-亲和素反应系统应用 包被抗体生物素标记抗体HRP标记亲和素,国产第四代HIV诊断产品明显缩短窗口期,25,结 论 HIV Ag/Ab诊断试剂,全新第四代 HIV 筛查试剂为使用者
6、提供 :,增强检验安全性,更可信赖的实验结果,2、乙肝系列诊断试剂,简 介,1、乙型肝炎HBsAg及HBsAb检测2、乙型肝炎HBeAg及HBeAb检测3、乙型肝炎HBcAb及HBcAb-IgM检测4、乙型肝炎前-S1及前-S2检测（大蛋白）5、乙型肝炎HBcAg及前-S1检测（ Dane颗粒）6、乙型肝炎核酸检测,乙肝标志物及临床意义1,乙型肝炎病毒（HBV）具有明显的种属及嗜肝特性，可致持续性病毒感染。我国属乙肝感染的高发区，乙肝表面抗原（HBsAg）的携带者超过10%。通常判断HBV感染及其状况的指标为HBV血清血标志物乙肝两对半、HBc-IgM、HBV DNA等。乙肝病毒（HBV）又称
7、Dane颗粒（丹颗粒），由外至内可分为包膜蛋白、核壳蛋白、HBV DNA等主要组成。包膜蛋白构成乙肝病毒表面抗原（HBsAg）核壳蛋白构成乙肝病毒核心抗原（HBcAg）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）,乙肝标志物及临床意义2,乙肝表面抗原（HBsAg） HBsAg于1963年在澳大利亚土著人血中发现，故也称为澳大利亚抗原（简称“澳抗”），具有免疫原性，可刺激机体产生相应的抗体，是机体感染HBV后最早出现的血清血指标。 HBsAg分为4个亚型：adr、adw、ayw和ayr。不同亚型的HBsAg刺激机体产生的HBsAb不同。,乙肝标志物及临床意义3,乙肝表面抗体（HBsAb） HBsAg刺激机体产
8、生的特异性抗体，能中和体液中的HBV，感染乙肝病毒后6-23周出现。见于乙肝恢复期、HBV既往感染和乙肝疫苗免疫后。HBsAb滴度10mIU表示具有保护性，可抵御同一亚型的再感染。,乙肝标志物及临床意义4,乙肝病毒核心抗原（HBcAg） HBV核心颗粒外表面具有HBcAg活性，但外周血中没有游离的HBcAg。HBcAg阳性表示有Dane颗粒存在，有传染性。,乙肝标志物及临床意义5,乙肝核心抗体（HBcAb） HBcAb是乙肝核心抗原的总抗体。感染HBV后最早出现的抗体是HBc-IgM抗体，它是乙肝病毒急性感染的重要指标，慢性肝炎的炎症活动期也呈阳性。核心抗体不是中和抗体，HBc-IgG抗体可持
9、续多年不消退，是既往感染的指标。,乙肝标志物及临床意义6,乙肝e抗原（HBeAg） HBV核心颗粒内表面具有HBeAg活性，也可以由HBcAg经蛋白酶降解后产生，在乙肝潜伏期后期出现，略晚于HBsAg。HBeAg阳性表示HBV在体内复制，有很强的传染性。 进入恢复期后，HBeAg随着HBsAg的消失而消失，其消失前后出现HBeAb。,乙肝标志物及临床意义7,乙肝e抗体（HBeAb） HBeAb的出现预示HBV复制减弱或中止，疾病可能向好的方向转化。HBeAg逐渐消失HBeAb逐渐产生的时期称为血清转换期，即由复制期转为非复制期。在这一时期可能出现eAg、eAb同阳的现象。HBeAb也不是保护性
10、抗体。,乙肝标志物产生的先后顺序,HBsAg(HBcAg)HBcAbHBeAgHBeAb,乙肝两对半模式,常见模式（出现率140%）,常见模式（出现率140%）,少见模式（出现率14%）,少见模式（出现率14%）,少见模式（出现率14%）,3、丙型肝炎诊断试剂,抗-HCV检测中HCV的抗原,简介,全称：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒方法：间接酶联免疫法（第三代）检测对象：血液标本中的HCV IgG 抗体原料：基因重组，包被NS3、NS4、NS5、CORE，片段齐全。,窗口期,检测针对HCV四种抗原的抗体第二代试剂在感染后平均10周左右可以检出第三代试剂感染后平均7-8周为阳性在极少数病例中，如免疫
11、抑制、肾功能衰竭等，抗-HCV可以保持阴性,检定所考评市场流通的HCV抗体检测试剂,发展方向,1、双抗原夹心法代表生产企业：北京万泰目前进度：完成临床考核，等待批准文号2、抗原抗体联合检测方法代表生产企业：美国伯乐目前进度：2009年在欧洲上市，2012年下半年引入中国,4、TP,简 介,全称：梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒方法：双抗原夹心酶联免疫法检测对象：血液标本中的梅毒总抗体原料：基因重组原料包被P15、P17、P47。,常用梅毒检测方法的比较,TP EIA 与TPPA的比较,标本：类风湿病人血清10份，乙肝病人血清20份，红斑狼疮病人血清6份。来源于解放军301医院。,结论：在被检测的36份
12、血清中，未发现假阳性反应。,万泰TP试剂对特殊标本的检测,检测单位：北医第一医院皮肤科、新疆HIV检测中心,结论：万泰梅毒EIA灵敏度较TPPA好,部分临床考核数据,6、胶体金系列,试纸条的结构及制造工艺,WT,1,2,3,4,5,6,7,8,8,1. 塑料底衬2. 黏合剂3. 硝酸纤维素膜4. 对照线5. 检测线6. 交联垫（样品垫）7. 吸水纸8. 保护膜,试纸条图解,试纸条工作原理,在硝酸纤维素膜的检测线上包被有特异性抗体，对照线上包被有兔抗抗体，另一个特异性抗体在标记胶体金后干燥于硝酸纤维素膜下端的玻璃纤维上。 当样品由于层析原理流动时，首先溶解干燥的金标sAb单抗，特异性HBsAg抗
13、原与其反应，在流过检测线时再和另一个单抗结合形成免疫复合物。由于包被单抗被固定在硝酸纤维素膜上，免疫复合物就被留下，逐渐形成肉眼可见的红紫色条带，此时该样品为阳性。继续流动到对照线时，金标sAb单抗和羊抗兔IgG结合显色，出现对照带。 当样品中不含HBsAg特异性抗原时，标记胶体金的单抗流过对照线时也可和该处的羊抗兔抗体结合也可形成红紫色条带，导致对照线显色。,WT,胶体金试纸条的优缺点： （1）优点:(a)灵敏度适中； (b)使用方便，适于快速诊断； (c)易于存放，效期长。 （2）缺点:(a) 应用时间短，范围小； (b)部分项目灵敏度较低； (c) 价格较贵。,三、新版药典对血筛试剂改进及意义,2010版中国药典新要求,2010版中国药典于2010年10月1号起正式执行其对血筛四项诊断试剂（HIV/HBsAg/HCV/ TP）的新要求：试剂反应时间均不低于60分（加样后）、30分（加酶后）、30分（显色）优化后的诊断试剂，在保证特异性不变的情况下，灵敏度均有不同程度的提高,新/旧反应模式重点操作参数对比,在血筛试剂方面的不同之处及意义,优势：1、灵敏度明显提高，提升血液安全级别；2、特异性显著提高；3、影响因素减少，变异系数提高；劣势：1、工作时间延长；2、实验过程要求提高。,61,谢谢！,
